AECOPD患者糖皮质激素受体基因多态性及其对治疗的影响

王宪刚，张永，周丽，李先华

慢性阻塞性肺疾病(COPD)目前是世界上第四大死因[1]。2012年，超过300万人死于COPD，占全球死亡人数的6%，COPD已是世界各地慢性发病率和病死率的主要原因。在全球范围内，由于持续暴露于COPD危险因素和人口老龄化，预计未来几十年的COPD负担将增加，该病已对全球造成巨大的经济负担，因此对COPD进行一系列的深入研究已迫在眉睫。GOLD全球诊治倡议指出COPD是一种炎症性疾病，全身性糖皮质激素治疗住院治疗的COPD急性加重期(AECOPD)患者或在急诊科就诊期间，已被证明可降低治疗失败率、复发率，改善肺功能和呼吸困难[2]。糖皮质激素是通过与其受体结合发挥抗炎活性，而糖皮质激素受体(GR)基因存在单核苷酸多态性(SNP)则可能影响受体亲和力。本研究对糖皮质激素受体基因D641V、R477H的多态性进行分析，并综合文献分析糖皮质激素受体基因多态性可能影响激素治疗的敏感性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017-2018年四川省内江市第一人民医院收治的AECOPD患者81例，男60例，女21例；年龄55～85(70.21±5.21)岁；体质量50～70(60.12±2.42)kg，体质指数(21.24±1.57)kg/m2。患者入院后肺功能检查：FEV1/FVC均<70%，FEV1占预计值百分比(FEV1%)(35.84±19.04)%。患者肺功能检查均在吸入支气管扩张剂后进行。体格检查、胸部X线片(胸部CT)、肺功能、动脉血气分析、血常规等检查符合AECOPD的诊断标准[3]。既往及现病史均无免疫性疾病、过敏性疾病史，无心脑血管疾病、心力衰竭、高血压、肾功能不全、癌症等严重疾病。患者均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 基因组DNA检测试剂盒(美基生物)；qPCR试剂盒：Probe FAST qPCR Kit Master Mix(2×) Universal(KAPA Biosystems)。肺功能检测仪(日本美能AS-507)；NAS-99分光光度计(ACTGene公司)；ABI7900HT实时定量PCR仪(ABI公司)；MGB探针(上海基康公司合成)。

1.3 方法 81例患者入院时均采集静脉血2 ml，检测糖皮质激素受体D641V、R477H基因多态性。采用磁珠法试剂盒进行基因组DNA提取，DNA浓度与纯度使用紫外分光光度计测定。GR基因的不同的SNP位点分别设计1对PCR引物和TaqMan探针，实时荧光PCR扩增，探针的5′端和3′端分别标记1个报告荧光基团和1个淬灭荧光基团，PCR扩增引物和探针荧光染料及序列见表1。PCR反应体系：KAPA SYBR FAST Master Mix(2×)Universal 5 μl，Primer F 0.2 μl，Primer R 0.2 μl，Probe1 0.25 μl，Probe2 0.25 μl，ROX 0.2 μl，DNA 1 μl，H2O补齐至10 μl。PCR反应条件为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃复性、延伸1 min，40个循环。使用定量软件导出原始数据及散点图，分析基因类型。

表1 PCR扩增引物和MGB探针荧光序列及染料

2 结 果

2.1 D641V基因多态性分析 糖皮质激素受体基因D641V位点的SNP号是rs104893908，等位基因为A/T，野生型基因AA，杂合子为AT，突变型为TT。Real-time PCR可见等位基因A的扩增曲线，未见等位基因T的扩增曲线，原始数据及散点图(图1)导入定量软件中分析，D641V位点的检测结果：AA型81例，AT型0例，TT型0例。

2.2 R477H基因多态性分析 糖皮质激素受体基因R477H位点的SNP号是rs104893913，等位基因为G/A，野生型基因GG，杂合子为GA，突变型为AA。Real-time PCR可见等位基因G的扩增曲线，未见等位基因A的扩增曲线，原始数据及散点图(图1)导入定量软件中分析。R477H位点的检测结果：GG型81例，GA型0例，AA型0例。

图1 rs104893908、rs104893913等位基因PCR扩增散点图

3 讨 论

1999年，核受体委员会将糖皮质激素受体及其基因正式命名为Nuclear receptor subfamily 3,group C,member 1(缩写：NR3C1)[4]，GR为核受体超家族成员之一。临床上存在糖皮质激素疗效差异的现象，部分出现明显的糖皮质激素抵抗。糖皮质激素敏感性降低的分子机制包括GR基因多态性及突变、GR表达水平降低、GR表达的不同亚型、GR复合物的分子伴侣等因素，其中GR基因多态性对糖皮质激素抵抗的作用可能被低估[5-6]。Hurley等[7]最先在家族性糖皮质激素抵抗患者中单独发现核苷酸2054 T>A，这种碱基变化导致氨基酸在糖皮质激素受体蛋白的641位置发生改变，天冬氨酸密码子(GAC)改为缬氨酸密码子(GTC)，其中突变纯合子TT型表现出严重的糖皮质激素抵抗，杂合子亲属仅有轻微的糖皮质激素影响。Ruiz等[8]发现有杂合的错义突变R477H，GR与激素结合后向核内的迁移减缓,失去转录激活功能。

虽然先后有学者发现D641V、R477H的SNPs影响糖皮质激素的疗效，COPD患者是否存在同样情况却存在疑问。部分使用较大剂量的糖皮质激素仍不能有较好疗效，其影响因素可能是多方面的，可能有复杂的机制。气道的慢性炎性反应不仅参与COPD的发病机制，还可能诱导糖皮质激素抵抗[9]；在肺泡巨噬细胞和T淋巴细胞中，上调GR-α和下调GR-β可提高激素敏感性，提示GR亚型可显著影响糖皮质激素的敏感性[10]；另外，GR的翻译后修饰，特别是GR磷酸化，同样可影响其对糖皮质激素的活性[11-12]。除去以上研究方向，鲜有学者研究COPD患者GR的SNPs与糖皮质激素的敏感性。

在支气管哮喘患者的糖皮质激素抵抗中，GR的SNPs研究相对深入。Ruiz等[8]不仅发现R477H突变,还进一步发现R477H野生型GG频率在哮喘抵抗患者中明显更低[13]，且R477H天然突变体通过影响GR的不同功能而引起广泛的糖皮质激素抵抗，这些功能跨越GR信号的级联系统的多个环节[14]。我国学者赵峰等[15-16]研究了激素抵抗型哮喘患者的糖皮质激素受体R477H、D641V的基因多态性，在抵抗型患者中R477H的GA、AA基因型数量明显高于敏感组和对照组，提示等位基因A可能是激素抵抗产生的因素。同样在D641V上等位基因T的频率高于敏感组和对照组，提示等位基因T可能是激素抵抗产生的原因。表明GR受体基因多态可能明显影响糖皮质激素在哮喘患者中的敏感性。既然在激素抵抗的哮喘患者发现存在GR基因多态性，预示COPD患者也可能存在GR基因多态性影响糖皮质激素的敏感性。

本研究就AECOPD患者的糖皮质激素受体基因位点D641V、R477H进行多态性分析，发现其基因均为野生型，未发现突变基因，说明D641V、R477H在COPD患者中可能突变率低，也可能与样本量小相关，需扩大样本量，并积极分析GR基因的其他单核苷酸多态，进一步研究GR基因多态性可能影响COPD患者糖皮质激素的敏感性。