不同比例有机无机肥配施土壤腐殖质组分的光谱学特征

仝利红，祝 凌，赵 楠，吕贻忠*，柳夏艳，蒋 珊，李应心

1.中国农业大学土地科学与技术学院，北京 100193 2.同济大学环境科学与工程学院，上海 200092 3.中山大学环境科学与工程学院，广东 广州 510275

引 言

土壤有机质是土壤最重要的碳(C)库，其含量变化不仅影响土壤质量，而且影响整个大气系统内C循环，因此提高土壤有机质含量对于提高土壤肥力和生产力、减缓温室效应具有深远意义[1]。土壤腐殖质是土壤有机质的主体部分，它是将来源于动物、植物、微生物等前体材料在微生物作用下经过一系列生物化学反应，形成了具有多相分布且结构复杂，含有羧基、羟基、酚基和醌基等官能团[2]的一类高分子化合物。由于前体材料类型及环境条件不同，所以土壤中形成的腐殖质具有“特异性”。张玉兰等研究表明，长期施用有机肥或氮磷钾混合施用使土壤腐殖质中小分子糖类物质减少，芳香类物质增加。窦森也指出不同环境条件下形成腐殖质的结构具有显著差异[3]。

土壤腐殖质包括胡敏酸(HA)、富里酸(FA)和胡敏素(HU)。HA和FA统称为腐殖酸，是腐殖质中的活性部分，具有较高的生物可利用性，HA和FA的分子结构之间差异显著，且在微生物作用下可相互转化，其物质组成和结构变化直接影响土壤的碳、氮循环[4]。Guo[5]研究表明HA和FA由于苯酚、羧酸、羟基等各种官能团的存在，从而促进了植物生长，有利于土壤养分和水分的保持，并且提高了土壤抑制病虫害的能力。因此，研究土壤中有机质的转化过程需要对其腐殖质组分的组成和结构进行研究分析，而单一的腐殖质组分结构的变化可能无法真实的反映有机质的转化机制。不同的施肥方式必然对土壤有机质的影响不同，然而目前关于施肥处理对土壤腐殖质结构的研究主要集中在单一组分结构的研究。

本研究以河北曲周长期定位试验为基础，以不同比例有机无机肥三种施肥方式为研究对象，采用元素分析、红外光谱和固态13CNMR三种分析方法研究不同比例有机无机肥混施对华北地区土壤HA和FA结构的影响，研究分析不同施肥处理土壤腐殖质组分的性质和结构差异，判断土壤有机质的演变程度，从而为土壤有机碳转化机制和有机培肥土壤提供理论基础。

1 实验部分

1.1 试验地点及田间试验设计

试验地点在中国农业大学曲周长期定位实验站(36°52′N，115°01′E)内，实验站于2002年3月建立，位于河北省邯郸市曲周县北部，属温带半湿润季风气候区，年均降雨量604 mm。试验在进行蔬菜生产的日光温室中开展，日光温室采用拱圆式的钢架结构，长52 m，宽7 m，占地面积约0.04 hm2。温室土壤为盐化潮褐土，砂粒含量54.11%，粉粒含量28.45%，粘粒含量17.44%。试验前土壤有机质16.94 g·kg-1，全氮1.24 g·kg-1，全磷1.61 g·kg-1，pH为7.68。

试验设计3个处理，共3个温室大棚，每个大棚内包括3次重复。2018年温室内采用番茄-芹菜轮作。试验处理如下：(1)F1：化肥为主(70%)，少量施用有机肥(30%)，(2)F2：50%化肥+50%有机肥，(3)F3：100%有机肥。施肥量为(1)F1，7 t·hm-1·year-1化学肥料，26.7 t·hm-1·year-1的生物有机肥，(2)F2：3.8 t·hm-1·year-1化学肥料，52.3 t·hm-1·year-1的生物有机肥，(3)F3：105 t·hm-1·year-1生物有机肥。供试肥料：试验用化肥为尿素(N 46%)、普通过磷酸钙(P2O512%)，氯化钾(K2O 50%)。生物有机肥为自制(N 1.21%，P2O50.6%，K2O 1.58%)，其主要原料为牛粪、鸡粪、棉仔饼、农作物秸秆等农业废弃物，经微生物发酵、充分腐熟处理，加工而成。

1.2 样品采集

试验地于2018年5月在大棚内进行土壤样品采集，取样深度为0～20 cm。取样时按S 型路线进行取样，每7个点为一个混合样。土样取回后，经风干、研磨和过筛后进行测定。

1.3 方法

1.3.1 腐殖质组分提取及纯化

将土壤样品腐殖质组分进行提取并测定其含量。土壤腐殖质组分的提取方法遵循国际腐殖酸协会(IHSS)的标准方法。取0.25 mm过筛的风干土样，将0.1 mol·L-1NaOH和0.1 mol·L-1Na2P2O7混合液(pH=13)按照水土比10∶1震荡、提取24 h后，3 000～4 000转离心15～20 min，上清液为腐殖酸溶液。收集的上清液使用0.5 mol·L-1H2SO4调节pH为1.0～1.5，静置过夜，然后离心进行固液分离，溶液即为FA，沉淀为胡敏酸。然后将得到的粗胡敏酸和富里酸分别进行纯化并进行红外光谱测定。将沉淀的HA置于透析袋内透析一周进行HA的纯化，以除去可溶性矿物盐；FA溶液则需要倒入树脂柱，将溶液通过树脂柱并收集滤液，此滤液为纯化后的FA。最后，将纯化后的HA和FA进行冷冻干燥。然后利用重铬酸钾氧化法测定HA和FA含量。

1.3.2 元素分析

采用 Vario EL Ⅲ(Hanau,Germany)元素分析仪测定样品中的C，H和N的含量，O含量通过差减法得到。

1.3.3 红外光谱测定

将冷冻干燥的土壤腐殖质样品进行红外光谱测定。样品粉碎研细至0.2 μm，然后将微量纯样品放在金刚石上压平后测试。所用仪器型号为：Nicolet 750 显微红外仪。测试范围为4 000～500 cm-1，检测器MCT/A，分束器KBr，扫描次数128次，分辨率设为8 cm-1。

1.3.4 核磁共振

采用Bruker AV 300型核磁共振仪测定，运用交叉极化魔角自旋(CP-MAS)技术获得了固体样品的13C核磁共振(13C-NMR)谱。13C的共振频率为75.4 MHz，魔角自旋的频率为12 kHz，接触时间为3 ms，循环延迟时间为5 s。积分面积由机器自动给出，各类型碳的相对含量用某化学位移区间面积比占总面积的比值表示。

1.3.5 数据统计分析

采用SPSS 20.统计分析软件对土壤腐殖质碳组分含量进行方差分析。将红外光谱和核磁共振数据利用Origin 8.0软件进行绘图。红外光谱数据统一采用Origin 8.0软件进行归一化处理。

2 结果与讨论

2.1 不同比例有机无机肥配施对土壤腐殖质组分含量的影响

图1所示，HA和FA含量均在F3处理内最高，分别为11.01和10.51 g·kg-1。与F1相比，F3使HA提高了106.01%，FA提高了180.22%，F2则分别提高了53.55% 和44.70%(图1)。我们的研究结果表明单施有机肥对于提升腐殖质组分含量优于化肥和有机肥混施。有研究表明有机肥对于提高土壤腐殖质组分含量的效果毋庸置疑[6]。本研究结果与之相同，有机肥显著提高了土腐殖质组分含量，其中高量有机肥的效果最好。也有研究者认为有机肥与化肥配施对于提高土壤腐殖酸含量优于单施有机肥(见本刊39卷第三期845页)，这可能与有机肥的数量密切相关。

图1 不同比例有机无机肥配施土壤HA和FA的含量Fig.1 HA and FA contents of soil under different ratios of organic and inorganic fertilizers

2.2 不同比例有机无机肥配施土壤腐殖质组分的元素分析

土壤胡敏酸(HA)和富里酸(FA)元素组成中C和O的占比最大，其次是H和N，HA中的C含量最高，FA中则O含量最高，并且HA中C、H和N的含量远高于FA，说明HA的缩合度较高、分子结构较复杂。不同配比的有机无机肥对HA和FA各元素含量及原子比影响不同。F3处理的HA中的C、H和N的含量最高，O含量最低，H/C，O/C和(N+O)/C的比值最低，说明单施有机肥HA中的芳香类物质最多，脂肪烃类物质和羧酸类物质最低。F1处理中C的含量最低，O的含量最高，H/C，O/C和(N+O)/C的比值最高，说明低量有机肥与化肥配施脂肪烃类和羧酸类物质最多(表1)。与F1相比，F2和F3降低了H/C，O/C和(N+O)/C的比值，说明有机肥的施用提高了HA的缩合度，降低了其氧化度和极性。C/N的比值在F2和F3中同样表现增加的趋势，并在F2中的值最大，说明有机肥能够促进HA中含氮化合物的形成，而有机无机肥配施的效果最好。

三种处理中，F2和F3处理提高了FA中C和N的含量，降低了H和O的含量，使FA的H/C，O/C和(N+O)/C的比值下降，而C/N的比值增加，表明了有机肥的施用同样提高了FA的缩合度而降低了氧化度和极性，促进了含氮化合物的形成，并且在F2处理中尤为明显(表1)。研究结果表明，有机无机肥混施对于FA结构的影响更加明显。综上所述，虽然有机肥的施用提高了HA和FA的缩合度，降低了氧化度和极性，然而不同比例有机无机肥配施对HA和FA的元素含量影响并不相同。

表1 HA和FA各种元素含量和原子比Table 1 Elemental concentration and atom ratio of humic acids and fulvic acid

2.3 不同比例有机无机肥配施土壤腐殖质组分结构的FTIR特征

图2 不同比例有机无机肥混施土壤HA的红外光谱Fig.2 IR spectra of HA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

图3 不同比例有机无机肥混施土壤FA的红外光谱Fig.3 IR spectra of FA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

表2 不同比例有机无机肥配施土壤HA和FA红外光谱主要吸收峰的吸光度比值Table 2 Ratio between main absorbance peaks of IR spectra of HA and FA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

2.4 不同比例有机无机肥配施土壤腐殖质组分结构的CPMAS 13C-NMR波谱特征

一般将腐殖质的CPMAS13C-NMR波谱分为5个主要的共振区，分别是烷基C区(δ0～50)、烷氧C区(δ50～110)、芳香C区(δ110～165)、羧基C区(δ165～190)和羰基C区(δ190～230)[7]。图4为HA的固态CPMAS13C-NMR波谱，不同施肥处理的HA在30 ppm处吸收峰明显并且在不同处理间的差异较大，30 ppm则代表长链烷烃或环烷烃结构中的亚甲基C。HA的烷氧C的峰主要在55 ppm处，归属为甲氧基C和碳水化合物C的吸收。芳香C区中，130 ppm主要是被羧基和羧甲基取代的芳香C；150 ppm代表的是酚羟基C。羰基C区中，170 ppm的峰代表的是羧基C。羰基C中，220 ppm处较弱的吸收峰代表的主要是醛基和酮基[8]。三种处理相对比，F2和F3处理提高了HA中烷基C和烷氧基C的含量，降低了芳香C、羧基C和羰基C的含量，从而提高了HA的脂化度而降低了芳化度，特别是在F2处理中烷氧C的含量达到了最高，而芳香C的含量最低(表3)。与F1相比，F3使脂化度提高了3.21%，芳化度降低了6.42%，F2则分别为14.26%和28.54%，说明F2和F3都能提高HA的脂化度，降低其芳化度，但F2处理对于HA官能团的影响更加显著。

图4 不同比例有机无机肥配施土壤HA的CPMAS 13C-NMR波谱Fig.4 CPMAS 13C-NMR spectra of HA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

FA与HA核磁共振图谱分区相同，可划分为5个主要共振区(图5)。在烷基C区中，20～30 ppm处吸收峰代表了支链和短链烷基C[9]。烷氧C区中，71 ppm为碳水化合物C的吸收峰。126 ppm(芳香C区)附近主要是被羧基或羧甲基取代的芳香C的吸收峰，176 ppm(羧基C区)代表的是羧酸、酯和酰胺C的吸收峰。羧基C区中，225 ppm较弱的吸收峰主要是酮，醌或乙醛。如表3所示，相较于F1处理，F3处理提高了FA的烷基C、烷氧C和羧基C的含量，降低了芳香C和羰基C的含量，F2处理则增加了烷氧C和羧基C的含量，而降低了烷基C、芳香C和羰基C的含量。在三种处理中，F3和F2处理都提高了FA的脂化度而降低了其芳化度。在F2和F3处理中，脂化度分别提高了2.89%和2.54%，芳化度则分别降低了7.18%和6.30%，说明F3处理对于提高FA的脂化度，降低其芳化度的效果更优。综上所述，有机肥的施用能够提高HA和FA的脂化度降低其芳化度，但是不同施用量有机肥土壤HA和FA的形成机制不同。

图5 不同比例有机无机肥配施土壤FA的CPMAS 13C-NMR波谱Fig.5 CPMAS 13C-NMR spectra of FA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

表3 不同比例有机无机肥配施HA和FA 的CPMAS 13C-NMR图的各官能团面积相对比例Table 3 Intensity distribution in the CPMAS 13C-NMR spectra of HA and FA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

3 结 论

有机肥的施用能显著提高土壤腐殖质组分含量，且施用量越大，含量越高。通过对腐殖质组分多种光谱分析结果表明，不同比例有机无机肥混施中HA和FA的形成机制不同。不同比例有机无机肥混施HA和FA元素含量变化不同。与低量有机肥与化肥混施处理相比，高量有机肥与化肥混施和单施有机肥处理都提高了HA中脂肪族化合物、碳水化合物物质的含量，FA的羧基基团、脂肪基团含量也增加，并且在单施有机肥处理中表现最为显著；高量有机肥与化肥混施则降低了HA中脂肪烃物质的含量，FA中的碳水化合物则达到最高。13C核磁共振波谱分析显示，随着有机肥的施用HA和FA的脂化度增加而芳化度下降，其中HA官能团变化在高量有机肥与化肥混施中更加显著，FA则在单施有机肥处理中变化更加明显。综上所述，有机肥显著提高了土壤腐殖质组分含量，并且提高了HA和FA的脂化度降低其芳化度，但是不同用量有机肥下HA和FA的形成机制不同。