利用宏基因组测序确诊肺结核及非结核分枝杆菌肺病各一例报道并文献复习

马潇枭，高宝安，牟干，刘玲

结核病及非结核分枝杆菌（non-tuberculosis Mycobacterium，NTM）肺病是全球重要的公共卫生问题，严重威胁着人类的生命健康。病原学检测结果是临床诊断结核病及NTM肺病的金标准，然而传统病原微生物检测技术面临着阳性率低、检测周期长等局限性，不能满足临床快速诊断的需求，尤其对那些临床症状及影像学特征不典型、痰抗酸杆菌涂片及培养多次阴性者作用有限，常导致误诊、误治[1-3]。宏基因组测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）通过直接测定样本中所有DNA/RNA基因组信息即可实现所有病原菌的鉴定及分型，在复杂性、混合性感染疾病的诊治中具有巨大潜力。近年来，mNGS在非典型结核病及NTM肺病诊断中也崭露头角[1-2，4]，本文报道了借助mNGS确诊的1例结核分枝杆菌及NTM混合感染引起的肺结核患者及1例NTM感染引起的NTM肺病患者的诊疗经过，并进行相关文献复习，旨在提高临床医生对这两种疾病的认识、鉴别诊断水平以及对mNGS在复杂感染性疾病病原微生物鉴定中应用的认识。

本文价值：

（1）本文报道了利用近期备受关注的宏基因组测序（mNGS）确诊的2例常规病原学检测阴性的疑难病例，其中1例确诊为结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌混合感染，1例确诊为非结核分枝杆菌肺病。通过病例报道及文献复习，进一步明确了mNGS在结核分枝杆菌感染及非结核分枝杆菌肺病中的应用价值，开拓了临床工作者对于疑难危重感染性疾病患者的诊疗思路。（2）通过对本文患者1的报道，提示在临床工作中，对常规病原学检测阴性而高度怀疑结核分枝杆菌感染的患者要反复行病原学检测；胸腔积液、外周血mNGS结果的迥异可能提示胸腔积液中结核分枝杆菌含量较低，外周血结核分枝杆菌检测也可能成为一种重要补充。（3）通过追踪患者2的诊疗全过程及结局，提升了临床工作者对非结核分枝杆菌肺病的重视，展示了mNGS在非结核分枝杆菌肺病诊疗中的优势。

1 病例简介

患者1，男，91岁，2020-05-04因“咳嗽、咳痰伴气促4个月，发热2 d”就诊于宜昌市中心人民医院。现病史：患者4个月前受凉后出现咳嗽、咳痰，咳白色黏痰，痰多不易咳出，伴活动后胸闷气促，无乏力、盗汗、消瘦，无胸痛、心悸、咯血，胸部CT检查提示“左下肺少许感染，左侧胸腔积液，慢性支气管炎”。2020-01-25，新型冠状病毒核酸检测阳性，于宜昌市第三人民医院住院治疗，2020-02-03及2020-02-05复查新型冠状病毒核酸检测阴性，好转出院。院外仍有间断咳嗽咳痰、活动后胸闷气促。患者2 d前无明显诱因出现发热，测体温最高达37.8 ℃，伴咳嗽、咳痰，咳少量白色黏痰，偶有胸闷气促，活动后明显，无畏寒、寒战，无鼻塞流涕、咽痛、胸痛、咯血；为求进一步诊治来本院。既往史：有慢性支气管炎病史多年；3个多月前诊断为新型冠状病毒肺炎，已治愈。有高血压病史4年，最高血压180/100 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），给予口服苯磺酸左氨氯地平片进行降压治疗，血压控制情况不详；有冠心病病史4年；2016年于武汉行冠状动脉支架植入术，并口服阿司匹林及辛伐他汀进行治疗；否认结核病及其他特殊疾病病史。体格检查：双肺呼吸音粗，左下肺呼吸音消失，右肺未闻及干、湿啰音，无胸膜摩擦音；余无特殊。2020-05-01曾于本院门诊行胸部CT检查，结果示：考虑左肺渗出或感染，左侧胸腔积液较前增多，左肺膨胀不全，慢性支气管炎，见图1A～D。心电图示：心房扑动；胸导联R波递增不良。床边心脏彩色多普勒超声检查示：双心房增大，左房室瓣轻度反流，右房室瓣中-重度反流。2020-05-04实验室检查示：红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）50 mm/1 h（参考范围0～43 mm/1 h），D-二聚体1.93 mg/L（参考范围0～0.50 mg/L），血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）14.05 mmol/L（参考范围3.60～9.50 mmol/L），肌酐（creatinine，Cr）128 μmol/L（参考范围57～111 μmol/L），C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）60.1 mg/L（参考范围0～10.0 mg/L），降钙素原（procalcitonin，PCT）＜0.05 μg/L（参考范围0～0.05 μg/L），N末端脑钠肽前体（N-terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP）1 544 ng/L（参考范围0～125 ng/L）；痰抗酸染色涂片、痰细菌/真菌培养、血培养无阳性结果，血常规、肝功能、电解质、心肌酶谱、甲型/乙型流感病毒抗原、支原体/衣原体免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）抗体、尿常规、便常规、抗可溶性抗原抗体、抗中性粒细胞胞质抗体未见明显异常。2020-05-05行胸腔穿刺引流术，胸腔积液常规检查示：黄色浑浊，蛋白定性试验阳性，有核细胞计数1 741×106个/L，中性粒细胞分数0.08，单核细胞分数0.03，淋巴细胞分数0.87，间皮细胞分数0.02；胸腔积液生化检查示：总蛋白（total protein，TP）56.45 g/L， 清 蛋 白（albumin，Alb）32.81 g/L，乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）412 U/L，腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）47.0 U/L，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）1.0 μg/L，结核分枝杆菌DNA阴性；胸腔积液细胞学检查：较多淋巴细胞，少量间皮细胞、中性粒细胞。肺癌六项：鳞状细胞癌相关抗原4.1μg/L（参考范围0～2.5μg/L），胃泌素释放肽前体70.4 ng/L（参考范围0～68.3 ng/L），其余指标处于参考范围；结核感染特异性T细胞检测阳性；鉴于患者高龄、基础状况差、胸腔积液增多及胸膜增厚原因不明、肺癌标志物稍高，不排除恶性肿瘤可能；2020-05-09正电子发射计算机断层显像（PET-CT）示：（1）左侧胸膜增厚，代谢增高；心包稍增厚，代谢增高；上述考虑炎性（结核病？）并左侧胸腔及心包少量积液。（2）慢性支气管炎；双肺结节影，代谢不高，考虑炎症。（3）右侧锁骨区、双侧腋窝、双肺门及纵隔淋巴结炎性增生。予以胸腔闭式引流，抗感染药物头孢他啶2.0 g、1次/12 h（2020-05-04至2020-05-09），效果欠佳；调整抗生素为莫西沙星0.4 g，1次/d（2020-05-10至2020-05-16）、哌拉西林他唑 巴 坦 3.375 g，1次 /8 h（2020-05-10至 2020-05-19）。2020-05-12胸腔积液mNGS结果（由北京金匙基因科技有限公司提供）示未检出病原微生物，见表1；2020-05-19复查胸部CT示：左侧胸腔积液较前吸收，左肺复张，左侧胸膜增厚，见图1E～H，临床高度怀疑结核分枝杆菌感染，再次送检外周血进行mNGS，2020-05-19回报检出结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuber-culosis complex，MTBC）及堪萨斯分枝杆菌，见表1，考虑结核分枝杆菌及NTM混合感染，转传染病医院进一步治疗。

图1 患者1胸部CT检查结果Figure 1 Results of chest CT examination in patient 1

患者2，男，56岁，2019-12-06因“畏寒、发热伴咽痛1 d”就诊于宜昌市中心人民医院。现病史：患者1 d前受凉后出现畏寒、发热，测体温最高达38.5 ℃，发热时感头痛、咽痛，伴有肌肉、关节酸痛，偶有咳嗽、咳痰，无鼻塞流涕、胸闷胸痛、咯血，无盗汗、乏力、食欲不振、消瘦，自行口服布洛芬缓释胶囊，上述症状无明显好转，为求进一步诊治来本院。既往史：有支气管扩张病史30余年，否认结核病及其他特殊疾病病史。体格检查：呼吸规整，双肺呼吸音粗，双肺未闻及干、湿啰音，无胸膜摩擦音；余无特殊。诊疗经过：2019-12-06血常规示：白细胞计数（white blood cell count，WBC）10.55×109/L（参考范围 3.50×109/L～9.50×109/L），中性粒细胞百分比（percentage of neutrophils，NE%）86.7%（参考范围40.0%～75.0%），淋巴细胞百分比（percentage of lymphocytes，LY%）6.3%（参考范围20%～50%），CRP 65.27 mg/L，PCT 0.06 μg/L；痰抗酸染色涂片、痰细菌/真菌培养及血培养均无阳性结果，支原体/衣原体IgM抗体阴性，肝肾功能、电解质、心肌酶谱、甲型/乙型流感病毒抗原、凝血功能、便常规及隐血试验未见明显异常。2019-12-06胸部CT检查示：左肺见斑片状影，左下肺支气管扩张，考虑感染，结核待排，见图2A、B。2019-12-11支气管镜检查示：左侧支气管管腔有大量脓性分泌物；左舌叶气管镜液基细胞学检查示：较多纤毛柱状上皮细胞，少量中性粒细胞、巨噬细胞、基底细胞。气管刷片细菌/真菌及抗酸染色涂片、肺泡灌洗液细菌/真菌培养、肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA、曲霉菌免疫学检查未见明显异常，结核感染特异性T细胞检测结果处于临界值、X-pert检测阴性。予以抗感染药物莫西沙星0.4 g、1次/d（2019-12-06至2019-12-11），哌拉西林他唑巴坦4.5 g、1次/12 h（2019-12-12至2019-12-18），止咳祛痰（溴己新、氨溴索）等对症支持治疗；2019-12-18复查胸部CT示：与2019-12-06胸部CT检查结果相比，双肺斑片状影较前增多，见图2C、D。复查支气管镜示：黏膜充血水肿，左侧支气管管腔内见脓性黏稠分泌物。行左下叶肺泡灌洗术，肺泡灌洗液抗酸杆菌阳性（+）：3～9条/100视野；遂诊断为肺结核。2019-12-20肺泡灌洗液mNGS结果（由北京金匙基因科技有限公司提供）示检出脓肿分枝杆菌（见表2），脓肿分枝杆菌基因组覆盖图见图3，修正诊断为NTM肺病，予以抗NTM治疗。2020-05-19复查肺部CT示双肺斑片状影明显吸收，见图2E、F。

2 讨论

结核病是全球十大死因之一，是发展中国家沉重的疾病负担，严重威胁着人类的生命健康。世界卫生组织发布的《2019年全球结核病报告》[5]显示，2018年全球约有1 000万（范围为900万～1 110万）结核病新发病例，约145万（范围为132万～158万）患者死于结核病。结核病由MTBC中的细菌感染引起，MTBC在核苷酸水平约有99.9%的相似度，临床常规微生物实验室检查难以精准鉴别，目前已知的MTBC包括人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、坎纳分枝杆菌、非洲分枝杆菌、海豹分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、Caprae分枝杆菌等，结核分枝杆菌是导致人类结核病最主要的病原菌[6-7]。结核分枝杆菌可侵袭人体任何系统器官，临床以肺部感染最常见，表现为原发性肺结核、血型播散性肺结核、继发性肺结核、支气管结核、结核性胸膜炎等。结核病一般临床诊断并不困难，然而近年随着糖尿病患者的增多、免疫抑制剂及抗肿瘤药物应用的增加等，免疫损伤人群明显增多，肺结核临床表现越来越多样化，而临床症状及肺部影像学表现不典型、痰涂片抗酸染色阴性的肺结核常易与普通细菌性肺炎、肺恶性肿瘤等疾病相互混淆，导致肺结核误诊、漏诊、误治率增加，严重影响患者预后[3]。

表1 患者1 2020-05-12胸腔积液mNGS结果及2020-05-19外周血mNGS结果Table 1 Results of mNGS in pleural effusion on 2020-05-12 and mNGS in peripheral blood on 2020-05-19 of patient 1

图2 患者2胸部CT检查结果Figure 2 Results of chest CT examination in patient 2

表2 患者2 2019-12-20肺泡灌洗液mNGS结果Table 2 Results of mNGS in bronchoalveolar lavage fluid of patient 2

图3 患者2脓肿分枝杆菌基因组覆盖图Figure 3 Genome coverage map of mycobacterium abscess in patient 2

结核性胸腔积液（tuberculous pleural effusion，TPE）是结核最常见的肺外表现，由结核分枝杆菌直接侵犯胸膜或者体内结核病灶复发间接导致，部分患者胸部影像学并没有发现明显的结核病灶[8]。据统计，我国住院胸腔积液患者中约40%为TPE；虽然实验室诊断技术的发展使TPE的诊断率提高，但仍有约20%的TPE患者无法明确病因[9]。结合本文患者1的临床症状、影像学检查、胸腔积液常规生化检查、ADA以及结核感染特异性T细胞检测结果，考虑结核性胸膜炎可能性大，然而其常规病原学检测均阴性，诊断不明；胸膜活检病理学检查对TPE诊断至关重要[10]，但是患者为91岁的高龄，基础状况差，有内科胸腔镜及支气管镜检查相对禁忌证，难以进一步明确病因，导致其临床诊疗再次陷入困境。征得家属同意后留取胸腔积液外送北京金匙基因科技有限公司进行mNGS，结果示未检出病原微生物；由于临床高度怀疑结核性胸膜炎，再次送检外周血进行mNGS，结果示检出MTBC及堪萨斯分枝杆菌，最终确诊为结核分枝杆菌及NTM混合感染。

基于二代测序技术的mNGS不依赖传统微生物培养，不需要特异性引物，单次运行即可测定样本中所有DNA/RNA基因组信息，实现所有病原菌的鉴定及分型，在临床常规检查反复阴性的复杂性、混合性感染性疾病的诊治中表现出巨大优势，近年来，mNGS在结核病诊断中的应用越来越多。2019年，ZHOU等[4]进行的一项评估mNGS在临床标本中直接检测MTBC诊断性能的前瞻性研究对105例临床怀疑活动性结核病患者的痰、脑脊液、脓液等直接临床标本进行培养，并进行X-pert检测和mNGS，其中有45例患者临床确诊为活动性结核病（13例肺结核和32例肺外结核病）；mNGS诊断活动性结核病的灵敏度为44%、特异度为98%，与X-pert检测的灵敏度（42%）相似，远高于常规涂片培养方法（29%）；表明二代测序技术能够快速检测多种标本中MTBC，灵敏度及特异度较高，可用于活动性结核病的早期辅助诊断。黄畅宇等[1]报道了利用二代基因测序技术诊断的1例复杂性肺结核患者。上述研究表明，mNGS在肺结核早期诊断中具有较大的价值。mNGS的另一大优势在于混合感染病原菌的鉴定，据报道，有10%～20%的结核病患者为混合感染[11]，同时其优越的分辨率能够区分复发和再感染[12]。本文患者1即利用mNGS确诊为结核分枝杆菌及NTM混合感染。结核分枝杆菌的耐药性是目前全球结核病防控的严峻挑战，也是亟待解决的难题，因而监测和了解结核分枝杆菌耐药性的发展、演变、生物学和流行病学特点相当重要，而mNGS能够快速筛选与结核病发展相关的多个耐药靶基因[13-14]，从而构建多重耐药结核和广泛耐药结核的个体化药物治疗方案[15-16]。相信未来mNGS必将在结核病诊断、治疗、传播链追踪和持续耐药性监测等方面发挥巨大潜力，为结核病的诊疗和控制做出杰出贡献。

近年来，NTM肺病发病率呈快速增加趋势，尤其是在结核病疫情较低的发达国家，NTM的分离率已超过了MTBC[17]。NTM是指除MTBC和麻风分枝杆菌以外的一大类分枝杆菌的总称，细菌学特点及抗原成分与结核分枝杆菌类似。据统计，目前共发现190多个NTM物种及亚种，致病的NTM中，鸟分枝杆菌复合群菌株以30.0%居于首位，其次是脓肿分枝杆菌（17.5%）和偶然分枝杆菌（13.0%），而我国较常见的为戈尔登分枝杆菌及脓肿分枝杆菌感染[18]。NTM可侵犯肺、淋巴结、皮肤和软组织等，以肺部感染多见，临床症状可表现为咳嗽、咳痰、咯血、低热、乏力、盗汗、消瘦等，多为慢性病程，亦可表现为急性病程[19]。结核病及NTM肺病患者临床症状及肺部影像学表现均类似，痰抗酸染色均可呈阳性，若未进一步菌种鉴定，易长期误诊为结核分枝杆菌感染[20]。本文患者2临床症状及肺部影像学表现无特异性，第2次支气管肺泡灌洗液检测出抗酸杆菌，遂误诊为肺结核，后来肺泡灌洗液mNGS检出脓肿分枝杆菌，最终确诊为NTM肺病。NTM肺病的诊断需结合呼吸系统以及全身临床症状、肺部影像学表现以及NTM分离培养；其中NTM分离培养是确诊NTM肺病以及区别肺结核的关键，常用方法包括传统液体和固体培养基培养、高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）、吖啶酯标记的DNA探针测定法、聚合酶链式反应（polymerase chain Reaction，PCR）或多重PCR法、PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）、DNA测序技术、反向杂交DNA扩增技术等[20-22]。mNGS在NTM鉴定中也表现出了相当的优势及潜力。FEDRIZZI等[23]利用二代测序技术对NTM的47个类型菌株进行了测序，其中快生型分枝杆菌11株、慢生型分枝杆菌36株，同时，重构和分析了41个以前未被描述的NTM物种的基因组，拓展了对NTM的认识。黄畅宇等[1]报道了湖南省人民医院2017年收治的1例常规抗结核治疗效果欠佳的患者利用mNGS确诊为NTM肺病，予以抗NTM治疗10 d后患者临床症状明显好转，复查CT示肺部病灶较前吸收。上述文献表明，mNGS在NTM肺病菌种鉴定、基因分型、流行病学调查以及临床诊疗、改善患者预后等方面发挥了巨大的作用。

结核病及NTM肺病是全球重要的公共卫生问题，临床工作中要进一步提高诊断准确率，减少误诊及漏诊。对高度怀疑结核分枝杆菌感染者，应充分结合常规抗酸染色镜检、结核杆菌培养以及分子生物学技术明确，早诊断、早治疗，改善患者预后。对于呼吸道标本抗酸染色阳性者，不可忽略NTM感染的可能，尤其对那些抗结核治疗效果差且持续痰涂片或痰培养抗酸杆菌阳性者，需要高度警惕NTM感染，应进一步完善菌种分型鉴定予以明确，以免延误诊断及治疗。mNGS作为一种新型病原学诊断技术，随着临床病例报道及病例对照研究的逐渐增多，在感染性疾病致病病原体鉴定中表现出了巨大的潜力及优势，可以作为临床常规检测反复阴性、经验性治疗效果差的疑难复杂性疾病的一种重要补充诊断手段。

作者贡献：马潇枭进行文章的构思与设计，撰写论文，对文章整体负责、监督管理；高宝安进行文章的可行性分析，负责文章的质量控制及审校；马潇枭、牟干、刘玲进行文献/资料收集与整理；牟干、刘玲进行论文的修订、英文的修订。

本文无利益冲突。

本文局限性：

首先，本文患者1因确诊后转往传染病医院进一步治疗，后续病例追踪中断。其次，本文报道患者的临床标本均外送北京金匙基因科技有限公司行mNGS，而非本院实验室检测。上述不足可能使本文结果存在一定偏倚。