抗寒桑树种质1-脱氧野尻霉素含量测定与分析

贾漫丽，李娜，李季生，范伟，王彬彬，杨晓东

(1 河北省高校特产蚕桑应用技术研发中心，河北 承德 067000；2 承德医学院 蚕业研究所，河北 承德 067000)

中医药书籍中记载桑叶味苦、甘，可以疏风清热、清肝明目并治疗消渴症。现代药理学研究表明，桑树含有的药用成分很多，以1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)为代表的生物碱是其中最重要的一种[1]。DNJ在动物体内表现出稳定的α-糖苷酶抑制剂的特性[2]，能有效抑制餐后血糖水平的升高，对预防和治疗Ⅱ型糖尿病[3]、高血压、高血脂症[4]等显示出良好的生物活性[5-6]。DNJ以桑树中含量最高(0.1%～0.6%)，是桑树区别其他药用植物最具有特色和代表性的次生代谢产物，也是研制新型降糖类药物的关键资源。

近年来，国内外学者在桑树DNJ的提取测定[7-8]、来源合成[9]、分布规律[10]、作用机理[11]等方面开展了大量的研究，为桑树DNJ的研究奠定了基础。李有贵等[12]报道了云南省来源不同的59份野生桑桑叶中的DNJ含量差异显著，最高含量达到0.791 1%，最低仅为0.004 6%。刘凡等[13]测定了广州国家桑树种质资源圃的98份桑树品种资源桑叶DNJ含量，结果显示品种间差异明显。张魏琬麒等[14]研究了桑叶中的DNJ含量随季节产生的动态变化规律，得出结论DNJ在7-8月份气温较高时含量最高。金超等[15]对华东蚕区5个栽培桑品种不同叶位DNJ含量进行测定，结果呈现上位叶>中位叶>下位叶的变化趋势。目前，对于河北地区保存丰富的桑树品种资源尚缺乏系统的调查研究和检测分析。基于此运用高效液相色潽法对承德地区保存的57份典型桑树种质资源的新梢进行DNJ含量测定，并进行评价分析，以筛选出适合北方地区生长的DNJ高含量的桑树品种(系)，为药用、食用桑树品种的选育提供依据，同时也为降血糖药物的开发提供优良的资源。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂和仪器

1.1.1 桑叶样品 供试桑叶样品于2018年6月底采自河北省承德市承德医学院蚕业研究所种质资源圃，57份桑树种质资源，每个桑树品种均采摘其新梢。将新鲜桑叶样品在-20 ℃冰箱预冻，再进行真空冷冻干燥，1段温度-40 ℃冻4 h，2段开始抽真空，每小时上升5 ℃逐渐升至35 ℃恒温。将干燥后的桑叶粉碎并过60目筛，装入密封的样品瓶-20 ℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 1-脱氧野尻霉素(DNJ)标准品(纯度≥98%)、9-芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)、色谱纯甲醇、色谱纯乙腈等均购自上海阿拉丁试剂，其他化学试剂均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 岛津LC-2030高效液相色谱系统，配有SPD-20AV紫外检测器；OHAUS AR224CN分析天平(奥豪斯仪器有限公司)，OHAUS卤素水分测定仪，KS-300EⅡ型超声波清洗机(宁波海曙科生超声设备有限公司)，VELOCITY 18R台式冷冻高速离心机(Dynamica)；Micro Pure UV/UF超纯水系统(Thermo)。

1.2 样品中DNJ的提取及含量测定

样品提取：精确称取待测样品250 mg，加入0.05 mol/L的HCl 25 mL，漩涡混匀2 min，超声波提取30 min，然后12 000 r/min离心30 min，收集上清液。沉淀物重复提取1次，合并上清液，用0.05 mol/L HCl定容至50 mL，即得到待测样品提取液[16]。

衍生化处理：取待测样品提取液200 μL于1.5 mL离心管，加入0.4 mol/L硼酸钾缓冲液(pH8.5)338 μL，再加入浓度5 mmol/L的衍生化试剂FMOC-Cl(乙腈250 μL，超纯水250 μL)，充分混匀，20 ℃下水浴20 min。加入1 mol/L甘氨酸(Gly)200 μL中和剩余的FMOC-Cl以终止反应，加入1%(V/V)醋酸溶液132 μL，以生成稳定的DNJ-FMOC。混匀后用0.45 μm微孔滤膜过滤，收集滤液备用[16-17]。

色谱条件：采用RP-HPLC紫外检测法测定，色谱柱为Kromasail-C18分析柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)及ODS3预柱(5 μm，4.6 mm×10 mm)，检测波长254 nm。室温25 ℃，柱温25 ℃，流动相为乙腈-0.1%醋酸混合相(55∶45，V/V)，流速为1.0 mL/min，进样体积20 μL，停止时间60 min。分析软件为Lab solutions色谱处理工作站，用外标法计算样品提取液中DNJ的含量。每个待测样本重复测定3次。桑叶中DNJ质量比(mg/g)=提取液DNJ浓度(μg/mL)×提取液体积(mL)/样品质量(g)/1 000。

1.3 标准曲线的制备和线性范围考察

配制浓度为1 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL的DNJ标准品溶液，各取200 μL按上述1.2的方法进行衍生化后，测定峰面积。以DNJ标准品溶液浓度X对色谱峰面积Y进行线性回归。标准品溶液在1～60 μg/mL质量浓度范围内，检测结果与实际数据呈现良好的线性关系，回归方程Y=11 283X-4 874.8，相关系数R2=0.999 9。

2 结果与分析

2.1 桑叶检出DNJ的高效液相色谱图谱

DNJ的高效液相色谱图见图1。

如图1(A-C)所示，试剂中的水解副产物 FMOC-OH 和 Gly-FMOC 色谱峰与测定的 DNJ-FMOC色谱峰能良好分离，不干扰测定目标成分的准确性。高效液相色谱显示DNJ标准品和样品中 DNJ-FMOC的保留时间为 5.838 min，与其他组分之间呈现良好的基线分离。

图1 桑树新梢样品中DNJ的高效液相色谱图Figure 1 HPLC of DNJ in Mulberry leaf tip samples

2.2 57份桑树种质资源新梢中DNJ含量比较

57份桑树种质资源DNJ含量检测结果见表1。

表1 57份桑树品种资源的桑树新梢中DNJ含量比较Table 1 Comparison of DNJ content in new shoot of 57 mulberry cultivars

表1(续)

表1(续)

57份桑树种质资源DNJ含量分布区间见图2。

图2 57份桑树种质资源新梢中DNJ含量分布Figure 2 The distribution of DNJ content in the new shoots of 57 mulberry germplasm resources

57份桑树种质资源的DNJ含量差异较大，质量比变幅为 1.288～5.183 mg/g。在供试品种中， DNJ含量最高的品种有2个，分别为辽宁的家桑(5.183 mg/g)，其次是河北的条墩桑(5.020 mg/g)；含量最低的是禾桑(1.288 mg/g)，最高含量与最低含量相差 4.02 倍。由图 2 可知，DNJ 含量的分布区间相对集中，质量比较高分布在 4.0～5.0 mg/g 之间有6 种，分别是山东牛筋，辽宁的宽甸 6号和凤凰山 6号，其余3个黑皮、张家口 25号、遵化白椹均来自河北；质量比分布在 2.0～3.0 mg/g 之间有21 种，占桑树品种资源总数的36.84%；质量比分布在 3.0～4.0 mg/g 之间有22 种，占桑树品种资源总数的 38.60% ；质量比较低的分布在1.0～2.0 mg/g 之间的有6个品种，分别为乌克兰 1号、鲁桑 6号、宜秋、勺桑、节曲、禾桑。

2.3 不同桑种及来源地区的种质资源DNJ含量比较

不同桑种的桑树种质资源DNJ含量比较见表2。

表2 不同桑种样品中DNJ含量比较Table 2 Comparison of DNJ content in different mulberry species

不同来源地区的桑树种质资源DNJ含量比较见图 3。

图3 不同来源地区的桑树品种桑树新梢中DNJ含量比较Figure 3 comparison of DNJ content in mulberry leaf tips of mulberry species from different sources

所检测的57份桑树品种资源中白桑和鲁桑占比最多，白桑有23个品种，平均DNJ质量比为3.374 mg/g，占桑树品种资源总数的40.35%，DNJ 质量比最高的 2个品种家桑、条墩桑均为白桑种。鲁桑有29个品种，平均DNJ质量比为 2.877 mg/g，占桑树资源总数的50.88%，说明白桑、鲁桑种在承德地区的适应能力较强。华桑仅有1个品种为涿鹿6号，鸡桑有2个品种分别为宽甸 6号和凤凰神 6号，DNJ 质量比均较高，都在 4 mg/g 以上。蒙桑品种仅有2个为蒙果桑和石门台蒙桑，DNJ 质量比分别为 2.276 mg/g ，3.303 mg/g。

由图3可知，57份桑树种质资源来自全国 11个省、市及自治区，以及朝鲜、日本和前苏联。其中河北的地方品种(系)或者栽培品种较多，数量达到 25个，平均DNJ质量比也较高，达到 3.212 mg/g。其次有6个品种引自山东，5个品种引自辽宁，分别有4个品种来自朝鲜和日本，极少数品种来自江浙及国内其他地区。研究结果表明，来源地区不同的桑树品种其DNJ含量差异较大，原产地河北的大部分品种DNJ含量均处于较高水平，其他地区则较低，这可能与本土品种的生态适应性相关，南方品种耐寒性较差，引进后生长势较弱，次生代谢产物积累的也相对较少有关。

3 讨论

DNJ首先是从桑叶根皮中分离得到，除了桑科植物以外，其他植物中也存在着DNJ，但含量极低[18]。已有研究表明，桑树品种、叶片部位、季节气候、发育阶段、处理方式[19-20]等均是影响DNJ含量的重要因素。其中，DNJ在桑叶中的分配量由大到小为春芽、嫩芽、嫩叶、成熟叶、老叶[10]。本研究运用高效液相色谱紫外检测法对河北省保存的 57份桑树种质资源进行DNJ定量分析。试验设计采样部位为桑树新梢，之所以选择新梢部位，是因为当有机物进入植物体内以后，向上传输到正在生长的枝叶顶端[21]，因此存在顶端优势，桑枝新梢叶中营养物质充足，活性物质含量也相应较高。试验结果显示，不同桑树品种新梢DNJ含量差异较大，原产河北、辽宁品种较多且DNJ含量较高。

DNJ 或许和其他次生代谢产物一样，在植物进化过程中发挥着重要的防御作用[22]。目前，针对不同地区不同品种桑树DNJ含量的测定和比较已有大量研究。李有贵、陈松[12，23]分别对云南省不同地域的野生、栽培桑树品种DNJ含量进行差异检测，结果显示，开远的岩桑DNJ含量最高，质量分数达到 0.791 1%，是可见报道中DNJ含量最高的桑树资源。丁俊男[24]研究发现，北方 8个桑树品种中黑龙江地方品种泰来桑上位叶中DNJ含量达到 4.20 mg/g，高于其他桑树品种。叶晶晶[10]用反相高效液相色谱法测定山东省有代表性的18个桑品种的摘芯芽中 1-DNJ 含量，沙 2×伦教 109 和秋雨最高，质量分数均达 0.328 0%左右。刘凡[13]所测华南地区(广州)的 98 份桑树品种资源中，多数供试桑树品种的桑叶DNJ含量分布在 0～1.00 mg/g 之间，其中育 7803 含量最高，质量比为1.54 mg/g。金超[15]报道华东蚕区 5个栽培桑品种育 711号、 7307 、湖桑 32号、金 10、新一之濑叶片中DNJ的质量比在 1.89～3.06 mg/g之间。禚苏[25]报道安康地区 24个桑树品种中旬阳青皮荆桑中的 DNJ 含量最高，为 0.381 5%。

与已有研究结果相比，本试验测定品种桑叶中DNJ含量相对较高，质量比变幅在 1.288～5.183 mg/g之间，最高含量的品种只低于云南省开远的野生品种岩桑。其中 2个品种达到 5.0 mg/g 以上， 6个品种在 4.0～5.0 mg/g 之间，75.0% 的品种 DNJ 质量比分布在 2.0～4.0 mg/g。可能与桑树长期以来生长的环境因素相关，气候温度作为环境胁迫因子，其变化可能会影响桑叶中次生代谢产物的合成表达与积累[24]。承德地区冬季寒冷，春秋气温偏低且昼夜温差较大，霜害严重，因此种质资源圃里的桑树品种大部分为河北省地方品种(系)，极少部分引种的南方品种经长期驯化也已经与环境产生一定的适应性[26]。有关DNJ在桑树体内的合成代谢机制，本课题组正在进一步研究。本试验结果显示，家桑、条墩桑、山东牛筋、黑皮、遵化白椹等品种DNJ含量较高，为选育高DNJ含量的桑树的药用、茶用及食品开发等提供了新的种质资源信息。此外，除了对DNJ含量有所了解，还要依据不同用途，综合考虑其他活性物质，如黄酮类、多酚类，以及品种叶片生长量和抗病性等方面，选择最佳品种应用。