莪术醇的分离鉴定及体外抗肿瘤作用机制研究

罗球珠，李穗晖，黄楚燕

（广州中医药大学第一附属医院，广东 广州510407）

目前对肿瘤特别是恶性肿瘤的治疗，常采用手术治疗和化学治疗（简称化疗）［1-2］。肿瘤化疗药物的选择是目前重要的研究方向之一［3］。莪术醇又名姜黄醇，为白色针状晶体，主要是从莪术油中提取而来，具有抗肿瘤作用，临床用于治疗宫颈癌效果较好［4］。但莪术油中含β-榄香烯等成分，不良反应较多，需提纯后使用［5］。本研究中对莪术醇进行了分离鉴定，并探讨其体外抗肿瘤效果。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：970CRT/XP型荧光分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；TGL-16M型离心机（济南来宝医疗器械有限公司）；CytoFLE型流式细胞仪（贝克曼有限公司）；WMS-1037型细显微镜（上海无陌光学仪器有限公司）；ZSP-350S型细胞培养箱（上海左乐仪器有限公司）；蛋白电泳及转膜仪及相关系统（美国伯乐公司）。

试药：复方莪术油栓（湖北四环制药有限公司，国药准字H20054798，规格为每枚50 mg）；B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）抗体（批号为20190603）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）抗 体（批 号 为20190606），半 胱 氨 酸 蛋 白 酶3（Caspase-3）抗体（批 号为20190601），均购自Santa Cruz Biotechnology公司；RPMI 1640培养基（广州威佳科技有限公司）；Ki67抗体、PCNA抗体均购自艾博抗中国公司；青霉素钠、磷酸缓冲液（天津科密欧有限公司）；AAnnexin V-FITC凋亡检测试剂盒（上海贝博生物科技公司，批号为BB-4101）；其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

细胞：宫颈癌细胞及肺癌细胞（中国科学院细胞库）。

1.2 方法

莪术醇的分离与鉴定［6-7］：取莪术油样品50 mL，置圆底烧瓶中减压蒸馏（208～216℃），收集馏分，用石油醚洗涤，用无水乙醇将馏分重结晶为白色晶，重复操作3次，得莪术醇供试品。莪术醇对照品和提取的莪术醇以石油醚溶解，采用油醚-乙酸乙酯显色，以紫外-可见分光光度法，于520 nm波长处测定并比较对照品和供试品的吸光度（OD）。

肿瘤细胞增殖的检测：在5%CO2、37℃条件下培养宫颈癌细胞、肺癌细胞，在RPMI 1640培养基中加入青霉素和链霉素各100 U/mL。取上述培养的对数生长期细胞接种至96孔板中，接种密度为5 000个/孔，分别加入1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/mL的莪术醇供试品和对照品继续培养72 h，加入20μL MTT溶液，静置4 h，去上清液后使用二甲基亚砜（DMSO）振荡溶解，在570 nm波长处测定OD。抑制率（%）＝（1-OD）/OD×100%。

宫颈癌细胞蛋白表达的检测：试验分为模型组、莪术醇组、莪术油组，分别加入相应培养液培养宫颈癌细胞。4℃下离心10 min，裂解后取上清。用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法后半干法电转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，37℃下封闭2 h，TBST清洗3次，加入相应抗体，常规孵育。加入ECL化学发光试剂，将PVDF膜放入暗盒，压上X胶片，然后取出胶片显影、定影、清洗。将目的蛋白的灰度值与内参蛋白β-actin条带灰度值比值为目的蛋白的相对表达水平。

宫颈癌细胞凋亡的检测：分组与培养同上，将上述宫颈癌细胞离心5 min（4℃，5 g）；收集细胞，分别加入100μL的Binding Buffer及5μL的PI和Annexin VFITC，在室温条件下避光孵育，加入400μL的Binding Buffer后以流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism5软件绘图及统计分析。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 莪术醇的鉴定

莪术醇供试品与对照品在同一位置显色（见图1），OD值及纯度见表1。

图1 对照品与供试品油醚-乙酸乙酯显色比较A.Reference substance B.Test substanceFig.1 Comparison of the oleyl ether-ethyl acetate strip of reference and test substance

表1 莪术醇吸光度比较Tab.1 Absorbance comparison of curcumol

2.2 肿瘤细胞增殖结果

结果见图2。莪术醇对宫颈癌细胞、肺癌细胞的抑制率均高于莪术油，莪术油对宫颈癌细胞、肺癌细胞的半数致死浓度（LD50）分别为9.01 mg/mL，9.91 mg/mL；莪术醇分别为8.21 mg/mL，10.01 mg/mL。

图2 肿瘤细胞增殖结果A.Zedoary turmeric oil B.CurcumolFig.2 The proliferation of tumor cells

2.3 蛋白表达及细胞凋亡结果

各组细胞增殖蛋白表达情况见图3，细胞凋亡蛋白表达情况见图4，细胞凋亡情况见图5。

3 讨论

图3 肿瘤细胞Ki67和PCNA蛋白表达A.Model group B.Curcumol group C.Zedoary turmeric oil groupNote：Compared with those in model group，*P＜0.05；compared with those in curcumol group，＃P＜0.05；as well as the following tables.Fig.3 The expression of Ki67 and PCNA protein in tumor cells

图4 Caspase-3、Bax和Bcl-2表达情况A.Model group B.Curcumol group C.Zedoary turmeric oil groupFig.4 The expression of Caspase-3，Bax and Bcl-2

图5 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况A.Model group B.Curcumol group C.Zedoary turmeric oil group D.Data statistics histogramFig.5 The apoptosis of each group detected by flow cytometry

莪术醇具有抑制肿瘤细胞增殖、侵袭等作用，同时可加快肿瘤细胞凋亡［9］。本研究中MTT试验结果显示，莪术醇对宫颈癌细胞、肺癌细胞均有较高的抑制率，且均高于莪术油对宫颈癌细胞抑制率。莪术醇对肿瘤细胞也有一定抑制作用，可能是因为莪术醇作用了肿瘤细胞的线粒体，使其受到抑制，影响其增殖能量代谢，从而抑制肿瘤细胞的增殖。蛋白质印迹试验结果显示，增殖细胞周期相关核抗原Ki67和PCNA表达水平均降低，说明肿瘤细胞分裂减慢。可能因为莪术醇中含有抑制增殖蛋白的氢化类化合物，减弱了其增殖能力。马希中［10］研究发现，莪术醇抑制癌细胞增殖，作用机制与下调PCNA基因的表达相关，与本研究结论一致。

调控细胞凋亡可有效阻滞肿瘤进展［11］。Caspase家族是调控细胞凋亡的重要基因之一，主要包括Caspase-3及Caspase-9等促凋亡基因，其水平升高说明细胞趋向凋亡。Bcl-2和Bax也是较常见调控凋亡的基因，其中Bcl-2为抗凋亡蛋白，Bax为促凋亡蛋白［12］。本试验中发现，莪术油组和莪术醇组促凋亡蛋白表达水平均显著升高，抗凋亡蛋白表达水平显著降低；相比莪术油组，莪术醇组Caspase-3和Bax蛋白表达水平均显著升高。同时，使用莪术醇的效果优于莪术油。莪术油中除了莪术醇可有效促进肿瘤细胞的凋亡外，还存在其他成分，使用同等浓度的两种物质，莪术醇的相对浓度较高，使得莪术醇对肿瘤细胞的凋亡促进效果优于莪术油。廖彬汛等［13］研究表明，莪术油具有促进直肠癌细胞凋亡的作用，与本研究得出的结论类似。

综上所述，莪术油可通过减压蒸馏的方式分离出莪术醇，两者均可以有效抑制肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡，且莪术醇效果显著优于莪术油。