滇产5种植物精油的抑菌性能及其成分分析

闫佳,牛延菲,史正军,雷福厚,赵平,吴春华,*

(1. 西南林业大学化学与工程学院，昆明 650224；2. 广西民族大学，广西林产化学与工程重点实验室，南宁 530006)

植物精油是植物次生代谢产物，是具有挥发性的一类油状液体。其成分多达100余种，包括醇类、醛类、酚类、丙酮类、萜烯类和酸类等，可随水蒸气蒸出[1]。研究表明，多数天然源植物挥发油具有杀菌、防腐、防虫等生物活性[2-3]。互叶白千层油可有效抑制灰霉病菌和大肠杆菌的生长[4-5],迷迭香油可作为杀菌剂有效抑制黄曲霉的活性[6],桉叶油对金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌等真菌抑制效果较好[7],丁香、肉桂精油能有效地抑制大米中青霉和黑曲霉的生长[8]。由于植物精油具有广谱抑菌活性、对人畜毒性小和不污染环境等优点，越来越多的植物精油受到人们的关注，可被广泛应用于化妆品、食品、饲料和医疗卫生等领域。

食源性微生物不仅造成食物的腐败变质，甚至会引起食物中毒，威胁到我们的生命。其中，霉菌在生活中十分常见，霉菌毒素是霉菌次生代谢产物，广泛分布在大米、小麦和深加工食品中[9]。当被人体误食或被皮肤吸收后，霉菌毒素常会引起机能减退、疾病乃至死亡。大多数产毒霉菌属于青霉菌属、曲霉菌属、镰孢霉菌[10]。

本研究以云南5种常见的植物资源为研究对象，用其挥发油针对主要食源性微生物进行抑菌活性研究，并通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析其抑菌的主要活性成分，以期为云南丰富的植物资源利用和发展天然健康的食品抑菌剂提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

冬青(IlexchinensisSims)油、蓝桉(EucalyptusglobulusLabill.)油、互叶白千层(Melaleucaalternifolia)油由云南森美达生物科技有限公司提供，均采用水蒸气蒸馏提取。5年生迷迭香(Rosmarinusofficinalis)采自西南林业大学树木园，3年生香叶天竺葵(Pelargoniumgraveolens)采自中国林业科学研究院资源昆虫研究所种植大棚。

绿木霉(Trichodermaviride)、黑曲霉(Aspergillusniger)、桔青霉(Penicilliumcitrinum)均购自广东省微生物菌种保藏中心。

水杨酸甲酯、二甲基亚砜、蔗糖和无水硫酸钠均为分析纯，琼脂(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，马铃薯(市售)。

1.2 试验仪器

超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，恒温培养箱(宁波东南仪器有限公司)，高压灭菌锅(华粤行仪器有限公司)，冷藏箱(浙江华美电器制造有限公司)，气相色谱-质谱联用仪(7890A-5975C美国安捷伦公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 植物精油的提取

选取供试植物叶片5 kg作为样品，洗去泥灰，剪碎成碎片备用。将样品置于水蒸气蒸馏装置中按常规水蒸气蒸馏法提取3 h，静置分层，取上层挥发油，加入无水硫酸钠干燥，得到精油产品，密封避光冷藏保存。

1.3.2 5种植物精油抑菌活性的测定

供试菌悬液的制备参照王安可等[10]的方法略加改进，将绿木霉、黑曲霉和桔青霉分别接种至直径90 mm的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，暗培养(28 ℃)，7 d后用无菌环挑取培养基表面的菌体放入研钵中，加生理盐水研磨至肉眼观察无块状，然后经无菌棉球过滤至三角瓶中，制备成菌悬液。血球计数板计数，用无菌生理盐水分别将3种菌的悬浊液稀释至浓度为1×106个/mL，在4 ℃冷藏箱保存备用。

抑菌活性的测定采用滤纸片法[11]，吸取3种菌悬液各200 μL移至PDA培养基上，用灭菌后的涂布棒涂布均匀，将培养基平均分为4个区间，每个区间分别放入直径为6 mm的灭菌滤纸片，其中3个滤纸片上分别注入5 μL植物精油，空白对照则注入5 μL蒸馏水，然后将培养皿用保鲜膜包好倒置放入28 ℃的恒温培养箱中，3 d后开始用十字交叉法测量抑菌圈直径[12]， 3次平行试验。

1.3.3 5种植物精油的最小抑菌浓度测定

参考牛彪等[13]的方法并稍加改变，用二甲基亚砜(DMSO)助溶，按照精油与DMSO体积比为1∶9分别将5种植物精油溶解，用蒸馏水将溶解的精油稀释成体积浓度为0.06，0.13，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00 μL/mL的溶液，与未凝固PDA培养基充分混匀后倒入培养皿中，待凝固后用移液枪吸取200 μL的菌悬液于培养基上，用三角棒涂布均匀，最后用保鲜膜包好放入28 ℃恒温培养箱培养。2 d后观察并记录培养基的情况，从而得出5种植物精油抑制绿木霉、黑曲霉和桔青霉的最小抑菌浓度。

1.3.4 5种植物精油的成分分析

植物精油的成分分析使用气相色谱-质谱联用仪，并参照董丽华等[14]的检测方法。色谱柱为Agilent DB-17MS 毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，色谱条件：程序升温(初始温度为70 ℃保持10 min，以5 ℃/min升至150 ℃保持2 min，以 10 ℃/min升至220 ℃保持10 min)，载气为高纯氦气，恒流模式，柱流量1 mL/min，平均线速度37 cm/s，进样量1 μL，进样口温度230 ℃，分流比50∶1。质谱条件：EI电离模式，电子倍增管电压1 913.0 V，电子能量70.0 eV，离子传输管温度250 ℃，离子源温度230 ℃，扫描质量范围30～550 m/z。

2 结果与分析

2.1 5种植物精油对3种霉菌的抑菌活性

5种植物精油对绿木霉、黑曲霉和桔青霉的抑菌活性试验结果见图1。

图1 5种植物精油对3种霉菌的抑菌活性Fig. 1 The antifungal activity of five plant essential oils against three molds

由图1a可知，前4天5种植物精油对绿木霉的抑菌活性关系为：冬青油=香叶天竺葵油>互叶白千层油>迷迭香油>蓝桉油，冬青油和香叶天竺葵油的抑菌活性保持不变，其他3种均呈现下降的趋势。从第5天开始冬青油和香叶天竺葵油的抑菌活性也呈现下降的趋势，冬青油下降得更为剧烈，但抑菌活性明显大于其他3种精油；蓝桉油和迷迭香油的抑菌活性持续性较差，到第6天、第7天已无抑菌效果；互叶白千层油的抑菌效果中等，但其抑菌活性的持续性较好。

由图1b可知，香叶天竺葵油对黑曲霉的抑菌效果最好，其次是冬青油，迷迭香油和互叶白千层油，蓝桉油的最差，几乎没有抑菌效果。前4天香叶天竺葵油和冬青油对黑曲霉具有同等的抑菌效果，从第5天开始冬青油和香叶天竺葵油的抑菌活性急剧下降。互叶白千层油和迷迭香油的抑菌效果持续性较好。

由图1c可知，5种植物精油对桔青霉有不同的抑菌作用，香叶天竺葵油和冬青油的抑菌效果最好，其次是互叶白千层油，迷迭香油和蓝桉油的抑菌效果相当，且持续性较好。

5种植物精油对绿木霉、黑曲霉和桔青霉3 d后的抑菌活性效果见图2。

图2 5种植物精油对3种霉菌3 d后的抑菌活性效果Fig. 2 Antifungal activity of five plant essential oils against three molds after 3 days

由图2可知，冬青油和香叶天竺葵油对绿木霉、黑曲霉和桔青霉的抑菌效果较强，培养皿内均无菌生长，这是由于精油植物挥发到整个培养皿中。蓝桉油对黑曲霉的抑菌圈直径为0 mm，对绿木霉的抑菌效果也较弱。迷迭香油对3种霉菌的抑菌圈直径较小，表明抑菌活性相对较弱。互叶白千层油的抑菌效果比冬青油和香叶天竺葵油差，但比迷迭香油和蓝桉油好。

2.2 5种植物精油的最小抑菌浓度

为了进一步确定冬青油、桉叶油、互叶白千层油、迷迭香油和香叶天竺葵油的抑菌效果，试验测定了5种植物精油的最小抑菌浓度(MIC)，结果见表1。冬青油、蓝桉油、互叶白千层油、迷迭香油和香叶天竺葵油对绿木霉的最小抑菌浓度分别为0.25，4.00，2.00，4.00和0.13 μL/mL，对黑曲霉的最小抑菌浓度分别为0.13，8.00，2.00，4.00和0.50 μL/mL，对桔青霉的最小抑菌浓度分别为0.25，8.00，4.00，4.00，0.50 μL/mL。其中冬青油的抑菌优势突出，在浓度为0.13 μL/mL时可以完全抑制黑曲霉的生长，对绿木霉和桔青霉的最小抑菌浓度均为0.25 μL/mL。香叶天竺葵油在浓度为0.13 μL/mL时可以完全抑制绿木霉的生长。互叶百千层油对3种霉菌的抑菌区间为2～4 μL/mL，迷迭香油对3种霉菌的抑菌区间均为4 μL/mL，蓝桉油的抑菌效果最差。

表1 5种植物精油对3种霉菌的最小抑菌浓度Table 1 Minimum inhibitory concentrations of five plant essential oils on three molds

2.3 5种植物精油的成分分析

利用GC-MS对精油成分进行分析，得到5种植物精油总离子流图，见图3。总离子流图中各成分经质谱工作站MSD ChemStation检测，利用NIST08标准质谱图数据库对化合物质谱进行检索对照，确定各种化学成分，并按色谱峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量。

a)冬青油；b)蓝桉油；c)互叶白千层油；d)迷迭香油；e)香叶天竺葵油。图3 5种植物精油的离子流图Fig. 3 Total ion chromatograms of five plant essential oils

由图3a可知，冬青油仅检测出水杨酸甲酯1种成分。相关研究报道了水杨酸甲酯是通过破坏细胞的完整性使重要离子从真菌细胞膜渗漏，从而导致膜通透性紊乱，细胞死亡，在抑制食品霉变上有很好的效果[15]。本研究的结果也表明，冬青油能很好地抑制绿木霉、黑曲霉和桔青霉的生长。

由图3c可知，互叶白千层油分离出36种成分，其主要成分有4-萜烯醇(42.68%)、γ-松油烯(13.69%)、(+)-4-蒈烯(6.32%)、对伞花烃(5.94%)、α-松油醇(4.59%)、萜品油烯(2.56%)，其中碳氢化合物共27种，占47.72%，醇类化合物共9种，占51.44%，酸类只有一种，占0.84%。其成分符合国家标准规定，即4-萜烯醇≥30%，1,8-桉叶素≤5%。Yu等[18]研究发现互叶白千层油中主要是4-萜烯醇通过破坏膜的完整性并增加渗透性，导致离子泄漏和膜功能障碍，其次起作用的成分为α-松油醇、萜品油烯，然后是1,8-桉叶素，还证明了4-萜烯醇可使细胞膜破裂，与1,8-桉叶素组合增加了细胞外的电导率，具有协同效应。Terzi等[19]也证实互叶白千层油中4-萜烯醇和1,8-桉叶素对真菌有较强的抑制效果。Li等[20]发现γ-松油烯在互叶白千层油中也占有较大的成分，该成分有较好的抑菌活性，但效力低于4-萜烯醇。An等[21]证实了互叶白千层油在抑制黑曲霉中α-松油醇和4-萜烯醇具有较强的抑制作用。本试验也表明，互叶白千层油对3种霉菌有一定的抑菌效果，但不如冬青油和香叶天竺葵油效果好。可能是互叶白千层油抑制霉菌的活性成分主要是4-萜烯醇、α-松油醇、γ-松油烯，存在4-萜烯醇与1,8-桉叶素的协同效应，其他活性成分对抑菌也有协同效应，但成分较少，抑菌活性不明显。

由图3d可知，迷迭香精油分离出38种成分。含量较高的化合物有1,8-桉叶素(21.02%)、马鞭草烯酮(16.89%)、3-蒈烯(15.14%)、香叶醇(5.72%)、龙脑(4.77%)、芳樟醇(3.25%)、柠檬烯(2.95%)。Prieto等[22]实验证明马鞭草酮对赤霉病链霉菌有极好的抑制作用，同时也具有抗肿瘤抗虫的广谱抑菌性。Souza等[23]研究发现亚马逊河的Aniba物种APEA含有40%的芳樟醇对黄曲霉、黑曲霉、镰刀菌、黑穗病菌和炭疽菌均有显著的抗真菌作用。丁雄等[24]对龙脑樟鲜叶挥发油成分研究时发现龙脑对细菌、酵母菌和霉菌均有一定的抑菌作用。王雪梅等[25]研究发现柠檬烯对真菌的抑菌活性比梨酸钾和苯甲酸钠更有优势，对灰葡萄孢菌的抑制显著高于月桂烯。因此，在迷迭香精油抑制真菌生长的过程中起主要作用的成分可能是马鞭草烯酮、香叶醇、芳樟醇、龙脑和柠檬烯。

由图3e可知，中香叶天竺葵油分离出41种成分，主要成分为β-香茅醇(48.74%)、甲酸香草酯(16.33%)、薄荷酮(6.29%)、β-人参烯(3.33%)、香叶醇(2.34%)、惕各酸苯乙酯(2.25%)。廖泽东等[26]通过体外抑菌实验研究香叶醇与柠檬醛联合使用对金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性，发现两者具有协同作用。Ortega-Ramirez等[27]的研究表明，柠檬醛和香叶醇抑制大肠杆菌的浮游生物生长，最小抑菌浓度仅1.0和3.0 mg/mL。吴建挺[28]研究发现，香茅醇和薄荷酮对灰葡萄孢和禾谷镰刀菌均表现出突出的抑菌活性。柠檬醛虽在精油含量中所占比例不大，但抑菌效果较强[29]。香叶天竺葵油成分中的β-香茅醇、香叶醇、薄荷酮和柠檬醛均表现出不同的抑菌活性，本研究也表明了香叶天竺葵油有较好的抑菌活性。

2.4 水杨酸甲酯的最小抑菌浓度

抑菌活性试验结果表明，冬青油对绿木霉、黑曲霉和桔青霉的抑菌效果较好，而且成分分析中仅检测出水杨酸甲酯1种成分。因此，本研究进一步测定分析纯水杨酸甲酯试剂对3种霉菌的最小抑菌浓度，结果见表2。由表2可知，水杨酸甲酯与冬青油的最小抑菌浓度结果一致，表明水杨酸甲酯试剂与天然提取的冬青油对绿木霉、黑曲霉和桔青霉具有相同的抑菌效果。

表2 水杨酸甲酯的最小抑菌浓度Table 2 The minimum inhibitory concentrations of methyl salicylate

3 结 论

云南省植物资源丰富，为植物精油的提取提供了充足的原料。本研究探索了冬青、蓝桉、互叶白千层、迷迭香和香叶天竺葵中挥发油的抑菌活性和成分。从抑菌效果来看，冬青油和香叶天竺葵油对绿木霉、黑曲霉和桔青霉的抑制作用均明显优于蓝桉油、互叶白千层油和迷迭香油；互叶百千层油和迷迭香油对3种霉菌的抑菌活性较弱；蓝桉油对3种霉菌的抑菌效果最差。最小抑菌浓度结果显示，冬青油对桔青霉、绿木霉和黑曲霉的最小抑菌浓度区间为0.13～0.25 μL/mL；香叶天竺葵油仅次于冬青油。通过GC-MS分析和分析纯水杨酸甲酯最小抑菌试验推断，冬青油中起抑菌作用的是水杨酸甲酯；蓝桉油最主要成分是1,8-桉叶素，占82.38%；互叶白千层油、迷迭香精油和香叶天竺葵油分别有36，38和41种成分，3种精油中最主要的成分都是醇类化合物，分别占53.63%，45.80%和51.44%。除冬青油仅有水杨酸甲酯一种成分外，其他4种植物精油成分复杂，其抑菌作用可能是由成分之间相互协同作用的结果。本研究不仅促进了对精油抑菌性能的了解，更为下一步研发复合精油抑菌产品提供了思路。