HPLC法测定食用动物油脂中丙二醛残留量

2021-02-01邹沫君陈诚

食品工业 2021年1期

邹沫君，陈诚

1. 乐山市食品药品检验检测中心（乐山 614000）；2. 山东高速四川产业运营公司（乐山 614000）

油脂受到光、热、空气中氧的作用，发生酸败反应，分解出醛、酸之类的化合物，丙二醛（MDA）是脂质过氧化物分解产物的一种，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性，从丙二醛含量可反映油脂过氧化的程度[1-2]。此外，丙二醛含量是反映机体抗氧化潜在能力的重要参数，可以反映机体脂质过氧化速率和强度，也能间接反映组织过氧化损伤程度，在机体衰老生理和抗性生理研究中丙二醛含量也是一个常用指标[3-4]。

试验根据丙二醛在较高温度及酸性环境中可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色的MDA-TBA化合物这一测定原理，对测定条件进行优化，显著节省前处理时间，减少有毒有害溶剂的使用和待测组分的损失，采用二极管阵列检测器，屏蔽杂质在紫外区对样品测定的干扰，方法快速、灵敏度高，适用于食用动物油脂中丙二醛残留量的测定[5-6]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5批试样（市售，包括1批食用猪油、1批食用牛油、1批食用羊油、1批食用鸡油、1批食用鸭油）；丙二醛乙缩醛（98.36%，Lot M1906002，2～8 ℃贮藏，Pure Chemland）；甲醇（色谱纯，北京百灵威科技有限公司）；三氯乙酸、乙二胺四乙酸二钠、硫代巴比妥酸（TBA）、乙酸铵（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）；实验室用水为超纯水（电阻率18.25 MΩ·cm）；0.22 μm水系进口聚醚砜PES滤膜（PALL公司）；双层定量慢速滤纸（杭州特种纸业有限公司）。

1.2 仪器与设备

DGU-20A3R岛津高效液相色谱仪（带SPD-M20A二极管阵列检测器，日本岛津公司）；CP-225D电子天平（Sartorius公司）；HH-6数显恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；SHA-B水浴恒温培养振荡器（常州冠军仪器制造有限公司）；UPT-Ⅱ-10T优普系列超纯水机（成都超纯科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Syncronis C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Thermo公司）；流动相：0.01 mol/L乙酸铵-甲醇=65∶35（体积比）；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量10.0 μL；SPD-M20A二极管阵列检测器波长200～800 nm，定值波长530 nm。

1.3.2 试样制备与提取

称取5 g（精确到0.001 g）均匀试样于100 mL具塞锥形瓶中，准确加入50 mL三氯乙酸混合液（准确称取37.50 g三氯乙酸及0.50 g乙二胺四乙酸二钠，用水定容至500 mL），在振荡器上以50 ℃、300 r/min振荡提取30 min，取出，冷却至室温，用双层定量慢速滤纸过滤，弃去初滤液，续滤液备用。

1.3.3 试样的衍生化

准确移取5 mL 1.3.2中滤液置于25 mL具塞比色管中，加入5 mL硫代巴比妥酸（TBA）水溶液，加塞，混匀，置于90 ℃水浴内反应30 min，取出，冷却至室温，取适量上层清液过0.22 μm水系滤膜，供HPLC分析。

1.3.4 标准溶液的配制

准确称取0.315 g（精确到0.000 1 g）丙二醛乙缩醛，用水溶解后稀释至1 000 mL，配制成100 μg/mL标准储备液，置于冰箱4 ℃储存，有效期3个月。将标准储备液用三氯乙酸混合液配成质量浓度1.00 μg/mL标准使用液，继续用三氯乙酸混合液稀释成0.01，0.05，0.10，0.15，0.25，0.50和2.00 μg/mL的标准系列溶液，现配现用。准确移取5 mL标准系列溶液与试样提取液一同衍生后，在设定的色谱条件下，浓度由低到高进行进样，采用外标法定量，作峰面积-质量浓度标准曲线，得到标准曲线回归方程。

2 结果与分析

2.1 HPLC检测谱图

在1.3.1的色谱条件下，丙二醛标准品溶液、试样溶液及试样加标溶液色谱图见图1～图3。

图1 标准溶液色谱图

图2 试样色谱图

图3 试样加标色谱图

2.2 线性关系、检出限和定量限考察

试验采用外标法，配制成1.3.4的标准系列溶液，在1.3.1的色谱条件下进样检测，得到丙二醛的峰面积与质量浓度的线性关系，拟合回归方程式，确定相关系数、最低检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），详见图4和表1。结果表明，丙二醛在0.01～2.0 μg/mL范围内线性关系良好，且该方法检出限低、灵敏度高，完全能满足丙二醛含量分析检测的要求。

图4 丙二醛标准曲线

表1 丙二醛的回归方程、相关系数、最低检出限、定量限

2.3 精密度考察

取1.3.4的线性第4点标准工作溶液，按1.3.1的色谱条件重复进样6次，记录丙二醛色谱图峰面积。计算RSD值为0.68%，表明仪器精密度良好，结果见表2。

表2 精密度试验（n=6）

2.4 重复性考察

取编号为食用猪油试样，按1.3.2、1.3.3的方法制备6份供试品溶液进行色谱分析，在1.3.1的色谱条件下测定丙二醛的残留量。计算RSD值为1.47%，表明方法重复性好，结果见表3。

表3 重复性试验（n=6）

2.5 稳定性考察

取制备好的编号为食用猪油试样供试品溶液，按1.3.1的色谱条件分别于0，4，8，12，16，20和24 h进样，测定丙二醛色谱峰面积，计算RSD值为0.28%，表明供试品溶液在24 h内稳定，结果见表4。

表4 稳定性试验（n=6）

2.6 耐受性考察

取1.3.4的线性第4点标准工作溶液，分别考察采用不同柱温（34，35和36 ℃），以及不同流速（0.9，1.0和1.1 mL/min）进行测定时仪器色谱行为的变化。以峰面积计，不同柱温条件下RSD为0.56%；不同流速条件下RSD为0.59%。表明在实际测定过程中色谱条件有微小变化时，食用动物油脂中丙二醛含量测定条件较宽，测定结果不受影响，系统具有较好的耐受性。

表5 耐受性考察表（n=3）

2.7 回收率考察

表6 丙二醛加标回收率（n=3）

分别取一定的食用猪油、食用牛油、食用羊油、食用鸡油、食用鸭油试样，添加0.1，0.2和0.6 mg/kg 3个浓度水平的丙二醛标准溶液。按照所建立的方法进行处理和测定，对每个添加水平做3次平行试验，计算丙二醛的平均回收率及其RSD值（见表6），考察方法的准确性。结果表明，丙二醛平均回收率在97.41%～102.25%，RSD值为1.08%～2.15%，方法准确度高，符合丙二醛分析检测要求。

3 讨论

3.1 流动相的选择

试验目的是快速、有效分离出丙二醛，参考文献[7-9]，采用0.01 mol/L乙酸铵溶液和甲醇作为流动相，进行等度洗脱。在优化的色谱条件下，目标物得到有效分离，缩短分析时间，且峰形良好，实际试样无干扰峰。

3.2 衍生反应温度的选择

取丙二醛标准溶液在50，60，70，80，90和100 ℃下分别与硫代巴比妥酸（TBA）水溶液反应，结果表明适当提高温度有利于衍生反应的进行，经测定，在90 ℃时生成衍生产物量最大，但继续升温对衍生产物的生成量影响不大，反而有下降趋势，为了避免其他副反应的产生，选择90 ℃作为衍生反应温度[10]。