UPLC-MS/MS法测定葡萄干中6种人工合成甜味剂

王远 ，邢丽杰，李先义，罗瑞峰，刘玉晗

1. 新疆农垦科学院（石河子 832000）；2. 石河子大学食品学院（石河子 832000）

葡萄干是一种具有丰富营养价值的干果，受到全世界的欢迎。葡萄干包含丰富的维生素和矿物质[1]。新疆是我国葡萄干的主要产区，葡萄干产量占世界总量的8.33%，居世界第四位，主要产于吐鲁番、哈密和南疆地区[2]。

人工合成甜味剂是一种能改善食品口味的外源添加剂，被广泛应用于食品加工行业。但是过量地使用或滥用甜味剂会危害人体健康，为此国家对甜味剂的使用范围及用量进行了严格规定[3]。GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[4]中对安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜等（图1）适用范围及添加限量均有明确规定。而在水果干类中，除了阿斯巴甜允许添加并作了相关规定外，其他均不得添加。

目前人工合成甜味剂的检测分析主要集中在白酒、饮料、乳制品等方面，检测方法主要有离子色谱法[5]、气相色谱法[4]、毛细管电泳法[6]、高效液相色谱法[7-9]、离子色谱-串联质谱法[10]、液相色谱-串联质谱法[11-14]等。其中离子交换色谱法前处理过程较为复杂，气相色谱法检测甜味剂需要衍生化，步骤繁琐。由于不同合成甜味剂的最大吸收波长不一致，液相法很难满足多种甜味剂同时检测的要求。液相色谱串联质谱法是近年来食品检测中常用的分析手段，具有选择性强、灵敏度高和抗基质干扰能力强等特点，已被广泛应用于甜味剂的检测。然而水果干中甜味剂的检测分析报道较少，同时国家标准中并没有关于水果干类样品的分析。因此此次试验通过对仪器参数和前处理条件的优化，建立一种超高效液相色谱-串联质谱测定葡萄干中人工合成甜味剂的方法。

图1 6种人工合成甜味剂结构式

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈、甲醇、甲酸（HPLC级，德国CNW公司）；亚铁氰化钾和乙酸锌（分析纯，上海安谱实验科技有限公司）；超纯水（18.2 MΩ·cm）。安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜和纽甜标准品（美国Dr公司）。葡萄干来自新疆不同地区超市和农贸市场，采集的葡萄干样品先经冷冻，然后进行粉碎，制备好的样品保存在-20 ℃冰箱中。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱串联质谱仪TQ-S（美国Waters公司）；MS3 basic漩涡混合器（德国IKA公司）；高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；KQ-600DE超声仪（江苏昆山市超声仪器公司）；超纯水仪（成都超纯科技有限公司）。

1.3 仪器参数

1.3.1 色谱条件

BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱温30 ℃，进样体积5 μL，流动相为0.05%甲酸水（A）-乙腈（B），流速0.4 mL/min，梯度洗脱：0～3 min，95%～80%（A）；3～5 min，80%～10%（A）；5～6 min，10%～95%（A）。

1.3.2

电质喷谱雾条离件子源，负离子电离（ESI-），脱溶剂气800 L/h，干燥气温度400 ℃，锥孔气50 L/h，离子源温度150 ℃。在分析过程中，以离子对（1母离子和2个子离子）信息比较进行定性分析；以母离子和响应值最高的子离子进行定量分析。6种人工合成甜味剂在多反应监测模式下质谱参数见表1。

表1 多反应监测离子对及质谱条件

1.4 样品处理

准确称取2.50 g制备好的葡萄干样品，加入10 mL 0.1%甲酸水，充分涡旋混匀，超声提取10 min。然后依次加入1 mL亚铁氰化钾和乙酸锌，涡旋混匀后以10 000 r/min离心5 min。上清液转移至25 mL容量瓶中。在残渣中继续加入10 mL 0.1%甲酸水涡旋混匀，超声提取10 min，以10 000 r/min离心5 min，合并上清液，用0.1%甲酸水定容至25 mL，混匀后过0.22 μm滤膜，上机分析。

1.5 线性范围及检出限

6种人工合成甜味剂混合标准溶液的配制：分别准确量取适量6种甜味剂标准储备液，用0.1%甲酸水逐步稀释成1，2，5，10，20，50，100和200 ng/mL的系列标准混合工作液。在优化的色谱和质谱条件下分析，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性拟合，分别得到6种甜味剂的线性方程和相关系数。分别计算3倍和10倍信噪时对应的浓度，作为方法的检出限和定量限。

1.6 回收率及精密度

为了考察方法的准确度和精密度，选取阴性葡萄干样品进行加标回收试验，分别添加低、中、高三个水平的6种甜味剂混合标准溶液，每个添加水平连续重复测定6次。按照1.4小节进行样品前处理，在1.3.1小节的色谱条件和1.3.2小节的质谱条件下测定，计算加标样品的回收率，同时计算其相对标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱分析

2.1.1 质谱参数的优化

分别配制质量浓度为1 μg/mL的6种甜味剂单个标准溶液，由于甜味剂大多带有羧基或羟基官能团，在电喷雾离子源内易形成负离子，且响应强度较好。因此，通过对离子源参数、母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量等参数的优化，得到6种甜味剂的最佳质谱参数，见表1。

2.1.2 分离条件的选择

试验比较了不同有机相体系（甲醇和乙腈）与水相（添加甲酸）组成对6种甜味剂信号强度和分离效果的影响。结果发现，在同样的流速下，甲醇-水体系比乙腈-水体系产生的色谱柱压力高，且超过了色谱柱最高耐压值，因此选择乙腈-水体系作为流动相。同时比较了乙腈-水、乙腈-0.05%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水体系对6种甜味剂信号强度和分离效果的影响。结果发现，6种甜味剂在乙腈-水体系（图2a）中较乙腈-甲酸水体系（图2b）中峰形对称性差、分离度低。在乙腈-甲酸水体系中，6种甜味剂在乙腈-0.05%甲酸水体系中响应高于乙腈-0.1%甲酸水体系（图3），故选取乙腈-0.05%甲酸水体系作为分离6种甜味剂的流动相。

图2 不同流动体系下6种甜味剂的总离子流图

图3 不同流动体系下6种甜味剂的响应

2.2 提取条件的选择

由于葡萄干样品本身糖分含量较高，直接提取后，溶液很难通过滤膜，因此在提取过程中加入亚铁氰化钾和乙酸锌进行沉淀。结果发现提取溶液的通过性较好。根据甜味剂的结构并结合标准SN/T 3538—2013《出口食品中6种合成甜味剂的检测方法液相色谱-质谱/质谱法》[15]中甜味剂的提取方法，比较了纯水、乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水（体积比1∶1）、甲醇-0.1%甲酸水（体积比1∶1）6种体系的提取溶剂对6种甜味剂的提取效率。结果表明，纯水、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水3种体系对6种甜味剂的提取效率相对较低，有些组分回收率不足60%。而甲醇-0.1%甲酸水体系对6种甜味剂的提取效率较高，但是甜蜜素、阿斯巴甜和纽甜的回收率均超过130%，这可能是由于甲醇-0.1%甲酸水体系提取了葡萄干基质中更多的其他组分，这些组分对甜味剂产生了基质增强效应。0.1%甲酸水和甲醇-水这2种体系对6种甜味剂的提取效率均较好，但是当0.1%甲酸水作为提取溶剂时，6种甜味剂的峰对称性好（图5a）；而当甲醇-水作为提取溶剂时，安赛蜜和糖精钠的峰均出现前伸，对称性差（图5b）。综上分析，采用0.1%甲酸水作为提取溶剂，能有效地提取葡萄干中6种甜味剂。

图4 不同提取溶剂下6种甜味剂的提取效率

图5 不同提取溶剂下6种甜味剂的总离子流图

2.3 线性相关性

采用外标法定量，在上述仪器条件下进行测定，以MS/MS定量离子色谱峰面积（y）对浓度（x）绘制标准曲线，并求出相应的线性回归方程及相关系数，6种甜味剂在相应的浓度范围内均具有良好的线性关系，且相关系数r均在0.99以上。按3倍信噪比和10倍信噪比计算，分别得到6种甜味剂的检出限和定量限，结果见表2。安赛蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜和纽甜的检出限均为1 μg/kg，糖精钠检出限为2 μg/kg；安赛蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜和纽甜的定量限均为2.5 μg/kg，糖精钠定量限为5 μg/kg。

2.4 方法的准确度和精密度

按照1.6小节进行回收率和精密度试验，计算加标回收率和相对标准偏差。从表3可以看出，阴性葡萄干样品在3个添加水平下6种甜味剂的回收率在81.5%～ 106.7%之间，相对标准偏差在1.7%～6.9%之间。结果表明，该方法测定分析的结果准确、可靠。同时该方法将保留时间和化合物碎片信息结合，进一步对化合物进行定性，大大降低了检测结果出现假阳性或假阴性的可能。

表2 6种甜味剂的保留时间、线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

表3 6种甜味剂的平均回收率和精密度试验结果（n=6）

2.5 实际样品的测定

图6 6种甜味剂标准品和实际样品的MRM图

利用建立的方法对新疆地区不同品种的50个葡萄干样品进行6种甜味剂检测，图6分别是标准品（图6a）和实际样品（图6b）的提取离子质谱图，结果均未检出6种甜味剂，这说明在葡萄干的加工和销售过程中，葡萄干在甜味剂的使用方面相对安全。

3 结论

此次试验通过对液相条件、质谱条件和提取条件的优化，建立了超高效液相色谱-串联质谱测定葡萄干中6种人工合成甜味剂的方法，并运用该方法对新疆地区葡萄干样品进行测定。该方法前处理简单，灵敏度高，时间短，线性关系、准确度和精密度良好，为葡萄干中人工合成甜味剂的检测提供检测依据，同时为水果干类中人工合成甜味剂的检测提供技术参考。