HPLC-RID同时测定艾纳香油中5种活性成分的含量

陈前袆 ，曹春月 ，陈伟，王鲁，何珺*

1. 贵州大学药学院（贵阳 550025）；2. 西南特色药用生物资源开发利用教育部工程研究中心（贵阳 550025）

艾纳香（Blumea balsamifera（L.）DC）为菊科艾纳香属多年生木质草本植物[1]，是提取艾纳香油、艾片以及艾粉的天然原料。艾纳香油可通过对艾纳香进行水蒸气蒸馏法、浸提法或溶剂提取法提取得到，其中主要含有L-龙脑、芳樟醇、樟脑、花椒油素、1-辛烯-3-醇、β-蒎烯、α-葎草烯等多种活性成分[2-3]。左旋龙脑[4]、芳樟醇[5-6]、樟脑[7]等具有很好的抑菌抗炎作用，花椒油素[8]具有抑制血小板聚集作用，1-辛烯-3-醇可用于食品添加剂。艾纳香油被广泛应用于药品行业，是我国贵州省特色药例“咽立爽滴丸”“万金香气雾剂”等的主要原料[9]。

目前关于艾纳香油的报道主要集中于艾纳香油的药理作用[10-11]、GC-MS化学成分分析[12]方面，GC检测艾纳香油中活性成分含量也有部分报道。陈宝雯等[13]建立了同时测定艾纳香油中β-蒎烯、芳樟醇、L-樟脑、L-龙脑、β-石竹烯、花椒油素含量的方法。吴丽芬等[14]建立GC法同时测定艾纳香油中β-蒎烯、芳樟醇、樟脑、L-龙脑、β-石竹烯5个成分的含量。陈贵等[15]建立GC法同时测定艾纳香油中左旋龙脑、樟脑、β-石竹烯3种成分的含量。对于建立艾纳香油液相测定方法还未见报道，而利用HPLC检测手段测定左旋龙脑、β-石竹烯等已有部分报道。例如：RP-HPLC测定艾纳香中花椒油素的含量[16]；HPLC-RID同时测定咽立爽口含滴丸中樟脑、石竹烯、龙脑、异龙脑含量[17]。此次试验建立HPLC-RID同时测定艾纳香油中花椒油素、樟脑、1-辛烯-3-醇、左旋龙脑及芳樟醇5种活性成分的含量，其中关于艾纳香油中1-辛烯-3-醇的含量测定还未见有相关报道。此次试验建立的HPLC-RID方法可为今后艾纳香油的质量控制及开发利用提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器与设备

BT25S型电子分析天平：塞多利斯科学仪器（北京）有限公司；安捷伦1100型液相分析色谱仪（RID检测器，安捷伦科技有限公司）；C18高效液相色谱柱（日本岛津分析仪器有限公司）；其他为一般常规仪器。

1.2 对照品

芳樟醇对照品（批号BCBV9483，德国SIGMA公司）；花椒油素对照品（批号AW13，Absin公司）；1-辛烯-3醇对照品（批号BCBV4944，德国SIGMA公司）；左旋龙脑对照品（批号B118615，Aladdin公司）、樟脑对照品（批号HH5S-R43G，中国食品药品检定研究所）。上述对照品均供含量测定用。

1.3 样品

艾纳香油于2017年11月3日分别购自贵州省罗甸县红水河镇平亭村（S1）、贵州省罗甸艾利康药业（S2）、贵州省罗甸全兴药业（S3）、贵州省罗甸艾原生态药业（S4）；2016年11月6日购自贵州省罗甸艾利康药业（S5）；2015年购于贵州省罗甸艾利康药业（S6）。2018年12月购自贵州省望谟（S7）；2019年购自江西海麟香料有限公司6批：其生产时间分别为2019年10月（S8），2019年9月（S9），2018年1月（S10），2016年4月（S11），2017年5月（S12）和2019年11月（S13）。

1.4 试剂

甲醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品储备液的制备

供试品储备液的制备：分别取50 mg S1～S13样品，加甲醇溶解并定容至5 mL，作为供试品溶液储备液。

2.2 混合对照品及供试品溶液的制备

混合对照品溶液的制备：取适量花椒油素对照品、樟脑对照品、1-辛烯-3-醇对照品、左旋龙脑对照品、芳樟醇对照品，加甲醇定容至5 mL，制成质量浓度分别为0.279，0.362，0.455，0.430和0.448 mg/mL的溶液，作为混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：分别取0.5 mL 2.1小节制备的供试品储备液，加甲醇定容至3 mL，得供试品溶液。

2.3 色谱条件

Supersil-T C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相甲醇-水（60∶40，V/V）等度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，进样量5 μL。

3 结果与分析

3.1 系统适用性

精密量取5 μL 2.2小节制备的同一批供试品溶液与混合对照品溶液进行HPLC分析，记录色谱图，见图1和图2。

图1 混合对照品HPLC图

图2 艾纳香油样品HPLC图

3.2 线性关系考察

精密吸取适量2.2小节制备的不同体积混合对照品溶液，分别置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得到系列浓度的混合对照品溶液。分别精密吸取5 μL系列浓度的混合对照品溶液进行HPLC-RID分析。以左旋龙脑、芳樟醇、花椒油素等5种对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归分析，结果见表1。取适量各对照品溶液，用甲醇稀释成不同浓度后直接进样，直到某一浓度出峰是仪器噪音的3倍时，得到仪器检出限，再乘以方法的稀释倍数除以方法的称样量得到方法的检出限。

表1 艾纳香油中5种成分的线性关系考察结果

3.3 精密度试验

精密吸取5 μL 2.2小节制备的混合对照品溶液进行HPLC-RID分析，重复进样6次进行HPLC-RID分析，记录色谱图。测得花椒油素、樟脑、1-辛烯-3-醇、左旋龙脑及芳樟醇的相对标准偏差RSD，分别为0.90%，0.53%，0.92%，0.64%和0.74%。表明仪器的精密度良好。

3.4 重复性试验

精密称取6份同一供试品，按2.1小节对供试品进行溶解并定容，得到供试品溶液，分别精密吸取5 μL上述供试品溶液进行HPLC-RID分析，记录色谱图。测得花椒油素、樟脑、1-辛烯-3-醇、左旋龙脑及芳樟醇的相对标准偏差RSD，分别为0.59%，1.12%，1.27%，1.26%和1.29%。表明此方法重复性良好。

3.5 稳定性试验

精密吸取6份5 μL 2.1小节制备的同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12和24 h在上述最佳色谱条件下进行HPLC-RID分析，记录色谱图。测得花椒油素、樟脑、1-辛烯-3-醇、左旋龙脑及芳樟醇的相对标准偏差RSD，分别为0.90%，1.42%，1.48%，1.49%和1.18%。表明艾纳香油样品在24 h内稳定性良好。

3.6 加样回收率试验

分别精密量取适量2.2小节制备的同一批供试品溶液，添加低（80%）、中（100%）、高（120%）三个水平的标样，溶解，摇匀，得到该试验项下的供试品溶液，备用。精密量取5 μL供试品溶液，在上述最佳色谱条件下进样测定并记录色谱图。测得花椒油素、樟脑、1-辛烯-3-醇、左旋龙脑、芳樟醇的平均回收率，分别为99.626 9%（RSD=1.15%），100.500%（RSD=1.29%），99.575%（RSD=0.97%），99.634%（RSD=1.45%）和99.614%（RSD=1.45%）。

表2 艾纳香油中各活性成分的加样回收率试验结果（n=3）

3.7 样品含量测定结果

精密吸取5 μL 2.1小节制备的13批供试品储备液，测定1-辛烯-3-醇和芳樟醇的总含量，重复测定3次，记录色谱图。精密吸取5 μL 2.2小节制备的13批供试品溶液，测定花椒油素、樟脑及左旋龙脑的总含量，重复测定3次，记录色谱图。计算出各批次艾纳香油各活性成分的含量范围：花椒油素26.264～54.410 mg/g、樟脑26.065～66.745 mg/g、1-辛烯-3-醇6.171～ 15.341 mg/g、左旋龙脑83.678～151.762 mg/g和芳樟醇4.780～12.953 mg/g。

表3 13批艾纳香油中各活性成分的含量测定结果（n=3） mg/g

4 讨论与结论

前期利用HPLC-DAD技术对该5种活性成分进行含量测定探究，其中左旋龙脑对照品与樟脑对照品在HPLC-DAD技术下其紫外吸收十分弱，以至于在紫外下几乎无峰出现，艾纳香油样品中的左旋龙脑在紫外下也无峰显现，同时1-辛烯-3醇、芳樟醇的紫外吸收也相对较弱，使得样品中该2种活性成分的峰很小，而花椒油素的紫外吸收较强，在常用360 nm下仍有紫外吸收，但是出峰时间相对较长，因此HPLC-DAD技术无法同时测定左旋龙脑、花椒油素、芳樟醇、1-辛烯-3-醇及樟脑的含量，并浪费时间与试剂。相对HPLC-DAD技术，此次试验采用的HPLC-RID方法简单，操作简便，且各活性物质的出峰时间很短，能同时测定该5种活性成分的含量，因此节省了大量的时间、精力及金钱。

在流动相选择上，比较了70%甲醇水、60%甲醇水和50%甲醇水对艾纳香油样品中活性成分分离度的影响，结果表明60%甲醇水较为适宜，70%甲醇水条件下样品的分离度差，分离不好，50%甲醇水条件下艾纳香油样品出峰时间过长，样品的峰面积低，故综合选择60%甲醇水为最佳流动相。

此次试验建立了HPLC-RID方法检测樟脑、1-辛烯-3-醇、左旋龙脑、花椒油素与芳樟醇的含量。色谱条件：Supersil-T C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相甲醇-水（60∶40，V/V）等度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，进样量5 μL。艾纳香油中花椒油素、樟脑、1-辛烯-3-醇、左旋龙脑与芳樟醇的含量范围分别为26.264～54.410，26.065～66.745，6.171～15.341，83.678～151.762和4.780～12.953 mg/g。试验表明，不同批次的艾纳香油中相同活性成分的含量差异较大，整体情况而言，左旋龙脑的含量最高，1-辛烯-3-醇的含量较低。此次试验所建立的液相检测方法操作简便，样品处理简便化；通过相关的方法学验证表明方法专属性强，检测灵敏度高，回收率好，重复性高，分析准确，为今后艾纳香油的质量控制提供参考依据，以及为只有HPLC没有GC的中药厂家及科研单位提供另一种检测方法，同时为艾纳香油质量控制与药效基础研究提供不同的检测方法，为艾纳香油质量检测及综合控制奠定基础。