LC-MS/MS测定果汁饮料中乳酸链球菌素

陈召桂，杨晋青，朱玲琳

1. 浙江五芳斋实业股份有限公司（嘉兴 314031）；2. 上海市质量监督检验技术研究院（上海 200233）

乳酸链球菌素（Nisin）是一种由部分乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）或乳酸链球菌（Streptococcus uberis）菌株产生的一种阳离子多肽，能够有效抑制大多数革兰氏阳性细菌的生长。乳酸链球菌素作为一种新型天然的生物防腐剂，较之传统防腐剂苯甲酸钠、山梨酸钾、丙酸盐、富马酸二甲酯，具有效果好、用量少、对人和生物生存环境没有破坏和副作用等优点[1-4]。GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[5]规定乳酸链球菌素使用范围和最大使用量，在饮料（14.01包装饮用水除外）中的最大使用量为0.2 g/kg（固体饮料按冲调倍数增加使用量）。国内外对乳酸链球菌素的检测方法研究成果较少，目前主要是使用琼脂扩散法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、高效液相色谱质谱法等[6-9]。这些检测方法各有优缺点，而高效液相色谱-串联质谱法具有溶剂用量小、分离效率高、检测灵敏度高、假阳性低等优势[10]。目前针对饮料中乳酸链球菌素的检测鲜有报道，故此次试验采用超高效液相色谱-串联质谱对果汁饮料中乳酸链球菌素进行检测，从而弥补这方面的空白，为乳酸链球菌素的检测方法标准的建立提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

乙腈、甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；乳酸链球菌素标准品（Sigma公司）。

乳酸链球菌素标准储备液（1.0 mg/mL）：称取0.100 0 g乳酸链球菌素于100 mL容量瓶中，用含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液溶解并定容至刻度，存放于4 ℃冰箱中备用。

乳酸链球菌素标准工作液：取1.0 mL乳酸链球菌素标准储备液，用含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液溶剂稀释至1.0 mg/L，备用。

乳酸链球菌素标准工作曲线溶液：用含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液稀释乳酸链球菌素标准工作液，使其质量浓度分别为100，80，50，20，10和5 μg/L。

1.1.2 仪器与设备

Agilent 1290液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；AB SCIEX QTRAP®6500质谱仪（美国Sciex公司）；TB-114型分析天平（Mettler Toledo公司）；涡旋混合器（德国IKA公司）；超声波清洗器（上海鲸德公司）；高速离心机（Eppendorf公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 液相色谱-串联质谱条件

色谱柱Agilent PLRPS-S C18（2.1 mm×150 mm，3.0 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脱；流速为200 μL/min；柱温为30 ℃；进样体积为20 μL。

质谱条件：离子化方式，ESI；扫描方式，正离子扫描；检测方式，多反应监测（MRM）；气帘气（CUR）10.0 psi；雾化气（GS1）40.0 psi；加热气（GS2）10.0 psi；喷雾电压（IS）5 000 V；去溶剂温度（TEM）400 ℃；去簇电压（DP）70 V；定量离子对m/z667.2/805.4，碰撞能（CE）20 eV；定性离子对m/z667.2/739.1，碰撞能（CE）20 eV。

1.2.2 样品前处理条件

准确称取5.00 g试样于50 mL离心管中，加入50.0 mL含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液，涡旋1 min，超声5 min，以9 000 r/min离心1 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液。

2 结果与分析

2.1 质谱方法

使用10 μg/mL乳酸链球菌素标准溶液，通过流动注射泵进入质谱进行母离子和子离子扫描优化，得到乳酸链球菌素的母离子、子离子及碰撞能量等质谱采集参数，如表1所示，其中m/z667.2/805.4为定量离子。

表1 质谱采集参数

2.2 液相色谱方法

2.2.1 色谱柱选择

乳酸链球菌素属于大分子类物质，色谱柱的大小、颗粒形状及粒径、颗粒表面积、孔径、封端技术等对其分离度有决定性影响，因此选择实验室常用XDB-C18、SB-C18、PLRPS-S-C18等色谱柱对乳酸链球菌素标准品进行分离研究，以便找出合适的色谱柱。最终发现PLRPS-S-C18柱效高、选择性好、分析速度快，因此将其作为乳酸链球菌素的检测。

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2.2.2 流动相的选择

流动相的种类及配比直接影响组分的分离，因此需要对流动相组成选择进行优化。因Nisin易溶于水，极性较强，质谱电离时带多个正电荷，故选择有机相-甲酸水体系作为流动相。使用100 ng/mL的乳酸链球菌素标准溶液进行液相色谱方法优化，分别选择甲醇-质量分数0.1%甲酸水和乙腈-质量分数0.1%甲酸水作为流动相进行梯度洗脱，洗脱梯度条件如表2所示。其中A相为质量分数0.1%的甲酸水溶液，B相为有机相，比较发现使用乙腈-质量分数0.1%甲酸水作为流动相时，洗脱能力好，质谱响应高且色谱峰较窄，故选择乙腈-质量分数0.1%的甲酸水溶液作为乳酸链球菌素检测的流动相。色谱图如图1所示。

表2 梯度洗脱条件

图1 乙腈-0.1%甲酸水的梯度洗脱色谱图

2.3 样品前处理方法

2.3.1 提取溶剂的选择

由于乳酸链球菌素易溶于水，并且溶解度随着pH的降低而显著增加，不能完全溶解于纯的甲醇、乙腈等有机溶剂，所以选择水、乙腈水溶液、含0.1%甲酸的乙腈水溶液分别作为提取溶剂，考察这3种不同提取溶剂对果汁饮料中乳酸链球菌素的提取效果。试验选取苹果汁饮料为基质样品，称取5.0 g试样并向其中加入500 μg/kg的乳酸链球菌素标准品，分别选用水、20%乙腈水溶液、含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液作为提取溶剂，然后对其进行超声提取（提取相同时间），重复测定6次，考察提取效率，结果见表3。

3种提取溶剂均能提取饮料中乳酸链球菌素。水对乳酸链球菌素提取效率较差，含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液提取效率明显较高，而且纯水难以过滤上机，存在杂质难以沉淀的问题，不便于前处理过程；含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液明显高于乙腈水溶液，而且考察到乳酸链球菌素在低pH下的溶解度较好，因此选择含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液作为最终的提取溶剂。

表3 不同提取溶剂对果汁饮料中乳酸链球菌素的提取效率

2.3.2 超声时间和温度的选择

超声提取时间是对测定结果影响较大的因素之一，因此选取不同的超声时间进行试验。分别选取5，10，15，20和30 min，在相同条件下进行分析测定，结果见表4。结果表明，随着超声提取时间的延长，提取效果提高不明显。由于样品是可溶性液体类饮料，乳酸链球菌素基本溶解在其中，只需满足基质效应低的提取溶剂下提取，故选择超声提取时间10 min。

表4 不同提取时间对果汁饮料中乳酸链球菌素的提取效率

2.3.3 线性范围与检出限

分别取20 μL质量浓度为100，80，50，20，10和5 μg/L乳酸链球菌素标准液，按上述色谱-质谱条件进行分析。以相应的色谱峰面积（y）为纵坐标、待测组分的质量浓度x（μg/L）为横坐标，绘制标准工作曲线，经线性回归求得相关系数，结果见表3。结果表明待测组分在该浓度范围内均具有良好的线性关系。

检出限定义：响应信号为噪音的3倍（S=3N）时所需的样品量；定量限定义：响应值为10倍基线噪音时所需的样品量。当取样量为5.0 g时，将一定浓度的乳酸链球菌素标准样品添加在空白基质样品中，定容体积为50.0 mL，在相同检测条件下进样6针，按检出限的定义分析数据，结果如表6所示。乳酸链球菌素的检出限为20 μg/kg，定量限为50 μg/kg。

表5 线性范围

表6 检出限结果

2.3.4 方法回收率和精密度

选取阴性空白样品基质（苹果果汁），分别添加低、中、高3个浓度水平（50，100和500 μg/kg），每一个添加水平重复测定6次，其回收率和精密度结果如表7所示。可以看出，回收率在79.5%～111.5%之间，且相对标准偏差（RSD）＜10%，能够满足试验要求。

表7 回收率和精密度试验结果（n=6）

2.3.5 市售样品分析

采集30个市售果汁饮料样品，按照样品处理方法对样品进行处理，根据仪器分析方法，对样品中的乳酸链球菌素上机分析，样品中均未检出乳酸链球菌素，可能是由于乳酸链球菌素较化学防腐剂价格较贵等原因，在果汁饮料领域使用较少。

3 结论

通过优化色谱条件和质谱条件，选择合适的提取溶溶液类型以及相应体积，建立LC-MS/MS测定果汁饮料中乳酸链球菌素含量的检测方法。该方法灵敏、准确、专一性强，适用于果汁饮料中乳酸链球菌素的定性与定量检测，可为果汁饮料中超限量使用添加剂提供有力的技术支撑，也为拓展到其他食品中乳酸链球菌素的检测提供理论基础。