蛋黄果营养成分测定及其多糖提取工艺

蒋边，李卫锦，李东娜，谢艳梅，霍平慧

岭南师范学院生命科学与技术学院（湛江 524048）

蛋黄果又名狮头果、桃榄、仙桃等，属山榄科蛋黄果属多年生植物。因其水分含量少，肉质为粉状，味道及口感都与鸡蛋黄相似，故称之为蛋黄果。蛋黄果原产地为古巴和北美洲热带，主要分布于中南美洲、印度、缅甸、越南、柬埔寨、泰国和中国南部。蛋黄果现已在我国海南、广东、广西、云南等地栽种[1-2]。蛋黄果果肉营养成分齐全，富含碳水化合物和膳食纤维，含有少量的蛋白质和脂肪，同时还含有多种维生素和矿物质，是一种优质的热带水果资源[3-4]。蛋黄果种子富含淀粉、粗蛋白、粗脂肪等营养成分，氨基酸组成丰富且配比合理，其中还含多酚、多糖、黄酮等活性物质[5]。目前，鲜见关于蛋黄果果肉氨基酸组成及其含量研究的报道。

植物多糖是一类天然大分子活性物质，广泛存在于植物体中，主要由醛基和酮基通过糖苷键连接的高分子聚合物[6-7]。现有大量的相关研究表明，多糖具有抗氧化[8]、抗肿瘤[9]、抗菌消炎[10]、降低血糖[11]、提高人体免疫力[12]等重要生物活性。因此，多糖在医药保健品、化妆品、食品等领域均有广泛的应用。植物多糖的提取方法有水提法、酸提法、超声波提取法、微波提取法等[13]，水提法提取多糖具有操作简单、成本低、适应性强等优势[14]，目前已被广泛应用于提取和生产植物多糖。蛋黄果果肉多糖含量较高[15]，蛋黄果的叶子、种子和树皮均有抗炎作用[16]，其种子、果肉和果皮提取物的抗氧化活性也很高[17-18]。

此次试验测定及分析蛋黄果果肉蛋白质、粗脂肪、总糖、还原糖、多糖和氨基酸等营养和活性物质的含量，并采用响应面优化水提法提取蛋黄果多糖的工艺，以期为蛋黄果的加工利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蛋黄果（市售）；使用化学试剂均为分析纯。

AX224ZH/E型电子天平（奥豪斯仪器（常州）有限公司）；SHZ-D型循环水（多用真空泵巩义市予华仪器责任有限公司）；Velocity 14R型台式高速冷冻离心机（天美（中国）科学仪器有限公司）；YRE-5299型旋转蒸发仪（巩义市予华仪器责任有限公司）；UV-3000P型紫外可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司）；WZZ-2B型自动旋光仪（上海申光仪器仪表有限公司）；SGM.M10/10H型箱式电阻炉（洛阳西格马炉业股份有限公司）；K9860型自动定氮仪（济南海能仪器股份有限公司）；FW135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；BCD-251WDGW型冰箱（青岛海尔股份有限公司）；L-8900型日立氨基酸分析仪（日立高新技术公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋黄果样品前处理

新鲜蛋黄果去皮、去核、切碎，置于55 ℃下烘干，打粉，再过孔径0.425 mm筛，保存于干燥器中。

1.2.2 蛋黄果营养成分的测定

采用常压干燥法测定水分含量[19]；采用直接灰化法测定粗灰分含量[20]；采用凯氏定氮法测定蛋白质含量[21]；采用索氏抽提法测定粗脂肪含量[22]；采用旋光法测定淀粉含量[23]；采用3, 5-二硝基水杨酸比色法测总糖和还原糖含量[24]；采用氨基酸分析仪测定氨基酸成分及其含量[25]。

1.2.3 蛋黄果多糖提取得率的测定

称取一定量样品，按一定液料比添加蒸馏水并混匀，在设定的温度下提取一定时间，按3 000 r/min离心10 min，弃沉淀取上清液，浓缩样液，加入一定体积95%乙醇，放置4 ℃冰箱24 h，按3 500 r/min离心25 min，弃上清取沉淀，加入适量超纯水复溶，后加入10%三氯乙酸除去蛋白质，再按3 500 r/min离心25 min，取上清液，用蒸馏水定容至200 mL，再取1 mL定容至10 mL得稀释的样品溶液。采用苯酚硫酸法测定蛋黄果中多糖的含量[26]，制作葡萄糖标准曲线，在490 nm处测定吸光度，以葡萄糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。同葡萄糖标准曲线制作方法，各取1 mL蛋黄果多糖样液进行测定，再按式（1）计算蛋黄果中的多糖提取得率。

式中：c为从标准曲线上求得的试样测定液中多糖含量，μg/mL；V为样液的总体积，mL；K为稀释倍数；m为蛋黄果样品质量，g。

1.2.4 蛋黄果多糖提取试验单因素设计

固定其他因素条件，以醇沉乙醇体积倍数（1，3，5，7和9倍）、提取时间（1.5，2，2.5，3和3.5 h）、液料比（30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，70∶1和80∶1 mL/g）和提取温度（50，60，70，80，90和100 ℃）为单因素，考察各因素对蛋黄果多糖提取得率的影响，确定其最佳因素水平。

1.2.5 蛋黄果多糖提取响应面试验设计

在单因素试验的基础上，进行响应面优化蛋黄果多糖提取工艺研究。以醇沉乙醇体积倍数、提取时间、液料比、提取温度作为4个考察因素，并确定4个因素的3个水平，以多糖提取得率为评价指标，进行响应面优化试验的中心组合设计。因素及其水平如表1所示。

表1 Box-Behnken中心组合设计的因素和水平表

1.3 数据处理

响应面设计与分析的软件为Design-Expert 8.05b；试验数据均为3次平行试验的平均值。

2 结果与分析

2.1 蛋黄果的营养成分及其分析

由表2可知，蛋黄果中蛋白质含量为5.07%，粗脂肪含量为3.82%，这两者含量较低；总糖和还原糖含量比较高，表明蛋黄果是一种碳水化合物含量较高的水果。蛋黄果总氨基酸含量为22.37 mg/g，必需氨基酸与总氨基酸含量比值（EAA/TAA）为38.89%，必需氨基酸与非必需氨基酸含量比值（EAA/NEAA）为63.64%，必需氨基酸含量与非必需氨基酸含量非常接近于FAO/WHO推荐的理想蛋白质标准[27]。此外，蛋黄果含多种矿物元素，钾、钠、镁、钙尤为丰富，且含有铁、锌、锰、镍等人体必需微量元素[28]。

表2 蛋黄果的营养成分含量（以干基计）

2.2 蛋黄果多糖提取的单因素试验结果与分析

2.2.1 醇沉乙醇体积倍数对多糖提取得率的影响结果与分析

如图1所示，多糖提取得率先随醇沉乙醇体积倍数的增加而增加，在醇沉乙醇体积倍数为3倍时达到最大值，之后随醇沉乙醇体积倍数的增加而减少，主要是因为加入乙醇可降低水溶液的介电常数，使多糖脱水沉淀；但乙醇体积的增加同时也使体系总溶液量增加，稀释了体系中目标物浓度，不利于多糖沉淀[29]。

图1 醇沉乙醇体积倍数对多糖提取得率影响

2.2.2 提取时间对多糖提取得率的影响结果与分析

如图2所示，多糖提取得率随提取时间先增加后减少，在2 h时多糖提取得率最大，此时多糖提取得率平均为3.88%。在试验范围内，蛋黄果多糖提取得率先随提取时间的增加而升高，原因可能是提取时间越长，多糖的溶解程度越充分，故多糖提取率升高；在2 h后多糖提取得率随时间的增加而减少，原因可能是时间过长，多糖降解及蛋白质等杂质产生[30]，导致多糖提取得率降低。

图2 提取时间对多糖提取得率的影响

2.2.3 液料比对多糖提取得率的影响结果与分析

如图3所示，多糖提取得率随液料比的增加而增加，当液料比为60∶1（mL/g）时，多糖提取得率最高，之后液料比增加，多糖提取得率呈下降的趋势。分析其原因可能是蛋黄果多糖主要存在于由纤维组成的细胞骨架中，液料比的增加可使更多的多糖扩散到骨架内部并溶解，所以多糖提取得率先随液料比的增大而增加。而当液料比达到最高点60∶1（mL/g）后，继续增加液料比，多糖提取得率反而有所降低[31]，而且液料比过高导致后续醇沉等工艺难度加大，提取成本增加。因此蛋黄果多糖提取的最佳液料比为60∶1（mL/g）。

2.2.4 提取温度对多糖提取得率的影响结果与分析

如图4所示，在试验温度范围内，蛋黄果多糖提取得率先随温度的升高而增加而后降低，在90 ℃时达到最大值。蛋黄果多糖提取得率在90 ℃之前随着提取温度的提高而增加，分析原因是温度的提高增加多糖的溶出速度；而在90 ℃之后则随提取温度的提高而降低，其原因可能是提取温度过高，会导致蛋黄果多糖分子降解或破坏，所以其多糖提取得率反而下降，在90 ℃时多糖提取得率达到最大值，因此蛋黄果多糖提取最优温度为90 ℃[32]。

图3 液料比对多糖提取得率的影响

图4 提取温度对多糖提取得率的影响

2.3 响应面分析法优化蛋黄果多糖提取工艺条件结果分析

2.3.1 响应面优化方差分析

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，设计四因素三水平的响应面分析试验。试验设计及结果见表3。

采用Design-Expert 8.05b软件对表3的数据进行二次多项式回归拟合，4个因素经过拟合得到蛋黄果多糖提取得率（Y）回归方程：Y=+4.68-0.40X1+ 0.17X2+0.18X3+0.30X4-0.065X1X2+0.30X1X3-0.087X1X4-0.30X2X3+0.007 5X2X4+0.12X3X4-0.46X12-0.41X22-0.40X32-0.76X42。表4中回归方差分析显著性检验表明，失拟项p=0.057 0＞0.05，不显著，表明该方程不失拟，说明这个模型合理且适合拟合试验，p＜0.000 1，方程模型达到极显著，说明能较好地拟合试验结果。

由表4分析可知，在所选的各因素水平范围内，影响蛋黄果多糖提取得率的因素按主次顺序为醇沉乙醇体积＞提取温度＞液料比＞提取时间。模型中的一次项X1、X4，平方项X12、X22、X32和X42对多糖提取得率影响极显著（p＜0.01）；一次项X2、X3对多糖提取得率影响显著（0.01＜p＜0.05）。由交互项p值可知，X1X3和X2X3交互作用显著（0.01＜p＜0.05），其他变量的影响均不显著（p＞0.05）。

由图5（a）可知，当醇沉乙醇体积不变时，随着料液比的增加，多糖提取得率先增大后降低；当料液比不变时，随着醇沉乙醇体积的增加，多糖提取得率先增加后降低，这与单因素试验结果吻合。分析图5（b），同样与单因素试验结果相吻合。醇沉乙醇体积和料液比、提取时间和液料比的等高线图均为椭圆，说明两两的均有交互作用，与方差分析结果吻合[33]。

表3 Box-Behnken中心组合的试验设计与结果

表4 多糖提取得率方差分析结果

图5 影响多糖提取得率的因素之间的交互作用

2.3.2 响应面最优条件优化、预测和验证通过回归模型的预测，得到蛋黄果多糖提取的最优工艺条件：醇沉乙醇体积1.88倍、提取时间2.11 h、液料比60.20∶1（mL/g）、提取温度90.51 ℃。此时，蛋黄果多糖提取得率预测值为4.82%。为检验RSM的可靠性，采用上述最优条件进行验证试验，同时考虑操作的方便性，将提取工艺参数修正为醇沉乙醇体积2倍、提取时间2 h、液料比60∶1（mL/g）、提取温度90 ℃，实际测得的蛋黄果多糖提取得率为4.88%。理论预测值与验证试验的平均值相接近，说明该模型可以较好地预测蛋黄果多糖提取得率。

3 结论与讨论

试验对蛋黄果营养物质进行测定，并对蛋黄果多糖提取工艺进行优化。相对于其他水果，蛋黄果的粗脂肪、蛋白质、总糖和还原糖含量较高；其氨基酸含量丰富且成分均衡，必需氨基酸与总氨基酸含量比值、必需氨基酸与非必需氨基酸含量比值达到联合国粮农及农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）推荐的理想蛋白质标准。通过响应面分析法对多糖提取工艺试验结果进行分析，得出影响多糖提取得率因素的主次排序：醇沉乙醇体积＞提取温度＞液料比＞提取时间。蛋黄果多糖的最优提取条件为醇沉乙醇体积2倍、提取时间2 h、液料比60∶1（mL/g）、提取温度90 ℃，此时，多糖提取得率为4.88%。

蛋黄果含有丰富的营养成分和活性物质，具有抗氧化等生物活性[15]和消炎、化痰、活血强身、提神醒脑、减压减脂等药用利用价值[3,34]，具备广阔的加工利用前景。目前对蛋黄果的研究多集中在蛋黄果果树的栽培育种研究上，对蛋黄果活性物质的提取和开发利用的研究比较少，此次试验所得蛋黄果多糖提取工艺简单、成本低、可重复性强，对于蛋黄果多糖的提取、生产和应用具有重要的参考意义，为蛋黄果的深入开发与利用提供了可行途径。