Bim和Otc4蛋白的表达对中晚期肾母细胞瘤患儿预后的评估价值

李艳丽 金建光 周亚丽 常新捷 冯珏利 闫俊强

肾母细胞瘤是15岁以下儿童常见泌尿系统恶性肿瘤，近年来其发病率在儿科肿瘤中占8 %左右，相关研究表明，男性患儿发病率略低于女性患儿[1]。另外，该肿瘤大多数患儿会在首次诊断后2年内出现复发[2]。目前该疾病仍采用病理类型和临床分期判断等较为传统的方法进行预后评估，但其可靠性和特异性无法保证，且病理类型判断主观性较强，因此局限性较大[3]。因而科学、客观的评价体系对评估肾母细胞瘤患儿预后的具有重要意义。

B细胞淋巴瘤-2促细胞凋亡(B-cell lymphoma 2 interacting mediator of cell death，BIM)基因是一种促凋亡基因，相关研究结果显示：肿瘤治疗过程中可导致Bim易位至线粒体，从而促进瘤细胞死亡，表明Bim基因的表达、转录对肿瘤的发生进展具有重要调控作用[4]。八聚体结合转录因子4(octamer binding transcription factor 4，Oct4)主要在人胚胎干细胞及生殖干细胞中表达，其功能是调控胚胎干细胞自我更新，另外相关研究发现其在恶性肿瘤细胞中出现过表达现象[5]。本文通过观察不同临床分期肾母细胞瘤患儿Bim和Otc4蛋白的表达差异，并分析其对患儿预后的评估价值，报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择2014年1月至2019年1月我院收治的中晚期(Ⅱ～Ⅳ期)肾母细胞瘤患儿64例，其中男性39例，女性25例，年龄8个月～11岁，平均年龄(7.66±1.23)岁，病理分期：Ⅱ期27例、Ⅲ期23例、Ⅳ期14例。另取所有患儿癌旁组织作为对照组(64例)。不同分期患儿一般资料见表1，所有项目相比差异均不具有统计学意义(P>0.05)，具可比性。

表1 患儿一般资料

1.2 入选标准

纳入标准：①12岁以下；②经临床病理学确诊为肾母细胞瘤；③未经过化疗、放疗、激素及免疫等治疗。排除标准：①合并其他恶性肿瘤史患儿；②临床资料不完整患儿；③不配合或不同意参与本研究者。本研究获得了本院伦理学研究委员会批准，入选患儿家属均知情同意本研究内容并签署同意书。

1.3 检测方法及指标

(1)采用免疫印迹试验(Western Blot)检测各期患儿肿瘤组织和癌旁组织中Bim和Otc4的表达。取肿瘤组织和癌旁组织，剪成小块，充分研磨为组织匀浆，全蛋白提取试剂盒(购自Abcam中国)提取蛋白，BCA蛋白定量试剂盒(购自Abcam中国)进行蛋白定量，然后上样，进行SDS-PAGE电泳(100 V 90 min)，转膜，染色，封闭，加一抗孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜后曝光、观察并拍照，图像分析软件获取所有组织Bim和Otc4表达的条带灰度值。(2)采用免疫组织化学检测癌旁组织和各期肿瘤组织中Bim和Otc4的表达，所用抗体为兔抗人Bim单克隆抗体和兔抗人Otc4免疫组织化学试剂盒(购自Abcam中国)。将组织固定并进行切片，根据试剂盒说明进行染色，最后DBA显色并观察。(3)阳性判定标准[6]：免疫组化染色结果呈浅黄至深褐色则表明该部位蛋白表达呈阳性，总体评价标准为：(++)和(+++)记为阳性，(-)和(+)记为阴性。(4)记录随访1年后，各期患儿预后情况，并进行分析和比较。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 Bim和Otc4蛋白在不同组织中相对表达量比较

与对照组相比，Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患儿癌组织中Bim蛋白相对表达量均显著降低，Otc4蛋白相对表达量均显著升高(P均<0.05)。与Ⅱ期患儿相比，Ⅲ期、Ⅳ期患儿癌组织中Bim蛋白相对表达量均显著降低，Otc4蛋白相对表达量均显著升高(P均<0.05)；与Ⅲ期相比，Ⅳ期患儿癌组织中Bim蛋白相对表达量显著降低，Otc4蛋白相对表达量显著升高(P均<0.05)。见表2。

2.2 Bim和Otc4蛋白在不同组织中表达阳性率比较

与对照组相比，Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患儿癌组织中Bim蛋白表达阳性率均显著降低，Otc4蛋白表达阳性率均显著升高(P均<0.05)。与Ⅱ、Ⅲ期患儿相比，Ⅳ期患儿癌组织中Bim蛋白表达阳性率显著降低，Otc4蛋白表达阳性率显著升高(P均<0.05)；而Ⅱ期和Ⅲ期相比，2种蛋白表达阳性率差异不具有统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表2 Bim和Otc4蛋白在不同分期患儿癌组织中相对表达量比较

表3 Bim和Otc4蛋白在不同分期患儿癌组织中表达阳性比较(例，%)

2.3 不同临床分期患儿预后情况分析

不同临床分期肾母细胞瘤患儿预后情况存在显著差异(χ2=23.220，P<0.05)。与Ⅱ期和Ⅲ期患儿相比，Ⅳ期患儿预后不良率显著上升(χ2=18.253，P<0.001；χ2=13.017，P<0.001)；而Ⅱ期和Ⅲ期患儿相比，预后情况无显著性差异(χ2=0.438，P=0.651)。见表4。

表4 不同临床分期患儿预后情况分析(例，%)

2.4 相关性分析

相关性分析结果显示，肾母细胞瘤患儿预后与其肿瘤组织中Bim蛋白的表达呈显著负相关(γ=-0.655，P=0.009)，与Otc4蛋白的表达呈显著正相关(γ=0.617，P=0.013)。

3 讨论

肾母细胞瘤也称Wilms瘤(Wilms tumor)，通常15岁以下儿童发病率较高，其总体发病率约占儿童肾脏肿瘤的95 %[7]。近年来随着医疗水平的提升，该疾病的治愈率已高达90%以上，但预后不良、双侧肾母细胞瘤以及复发患儿的生存率相对较低，如何对患儿预后进行准确评估、避免复发以提高肾母细胞瘤的根治效果，这也是近年来该肿瘤的热点研究内容之一[8-9]。

Bim和Otc4蛋白是在多种肿瘤(如，肾母细胞瘤、卵巢癌、肝癌等)的发生进展中起调控作用的指标，可用于肿瘤治疗效果的评价[10-12]，但未见二者在不同临床分期肾母细胞瘤患儿肿瘤组织表达情况的差异以及对患儿预后影响的相关研究。本研究通过对不同临床分期肾母细胞瘤患儿肿瘤组织及癌旁组织中Bim和Otc4蛋白表达进行检测，结果表明：与对照组相比，Ⅱ期组、Ⅲ期组和Ⅳ期组患儿癌组织中Bim蛋白相对表达量均显著降低，Otc4蛋白相对表达量均显著升高(P均<0.05)；与Ⅱ期组相比，Ⅲ期组和Ⅳ期组患儿癌组织中Bim蛋白相对表达量均显著降低，Otc4蛋白相对表达量均显著升高(P均<0.05)；与Ⅲ期组相比，Ⅳ期组患儿癌组织中Bim蛋白相对表达量均显著降低，Otc4蛋白相对表达量均显著升高(P均<0.05)，可知：随着肾母细胞瘤患儿病程的发展，肿瘤组织中Bim蛋白相对表达量逐渐下降，Otc4蛋白相对表达量逐渐升高，分析其原因在于：Bim作为一种促肿瘤凋亡基因，其在正常组织中发挥抑癌基因的作用，可正常表达，而在肿瘤组织中其活性受到抑制，从而促进了肿瘤的发生和进展，而Otc4常在恶性肿瘤细胞中过表达，与前人研究结果一致[12-14]。

另外，与对照组相比，Ⅱ期组、Ⅲ期组和Ⅳ期组患儿癌组织中Bim蛋白表达阳性率均显著降低，Otc4蛋白表达阳性率均显著升高(P均<0.05)，与前文两种蛋白相对表达量检测结果一致。而与Ⅱ期组和Ⅲ期组相比，Ⅳ期组患儿癌组织中Bim蛋白表达阳性率显著降低，Otc4蛋白表达阳性率以及不良预后患儿例数显著升高(P均<0.05)，而Ⅱ期组和Ⅲ期组相比，两种蛋白表达阳性率以及患儿预后情况差异不具有统计学意义(P均>0.05)。表明不同临床分期患儿Bim和Otc4表达阳性率与患儿预后情况均存在显著差异。进一步分析可知：肾母细胞瘤患儿预后与其肿瘤组织中Bim蛋白的表达呈显著负相关，与Otc4蛋白的表达呈显著正相关，因此可通过检测肾母细胞瘤患儿肿瘤组织中Bim和Otc4的表达情况对不同分期患儿预后进行评估。

本研究不足之处在于样本量较少，仅提出该两种指标用于评估肾母细胞瘤预后，但并未给出其具体评价标准，将在后续研究中扩大样本量进行深入分析。综上所述，Bim和Otc4蛋白的表达可用于评估中晚期肾母细胞瘤患儿预后，患儿肿瘤组织中Bim和Otc4表达量及阳性率随肿瘤发生和进展出现显著变化，且肾母细胞瘤患儿预后与其肿瘤组织中Bim蛋白的表达呈显著负相关，与Otc4蛋白的表达呈显著正相关。