巨细胞病毒感染耳蜗上皮细胞差异表达的miRNA筛选及验证

李俎怡何蓉

1中国医科大学附属盛京医院临床遗传科（沈阳 110001）

2珠海市妇幼保健院检验科（遗传研究所）（珠海 519000）

耳聋是影响人类健康和致残的常见疾病，据统计平均每1000个新生儿中就有1-3个耳聋患者[1,2]。耳聋可以由基因突变引起，也可由环境因素（如细菌感染、病毒感染、声损伤等）或基因和环境互相作用引起[3]。其中50%的耳聋被认为与环境因素有关[4]。研究表明，儿童的中、重度耳聋30%与先天性巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）感染有关[5]。巨细胞病毒，是一种具有双链DNA的疱疹病毒，属于疱疹病毒B亚科，且具有种属特异性。CMV感染在人群中普遍存在，新生儿出生时感染率达0.2%—0.3%[6]。先天性CMV感染已被证实是婴幼儿非遗传性感音神经性聋（Sensorineural hearing loss，SNHL）的最主要原因。大多数情况下的SNHL发生伴有耳蜗感觉毛细胞和神经结构受损。CMV感染内耳有多种途径，传染性病原体既可以通过与耳蜗外淋巴隔室相邻的大脑脑室储液池进入内耳，也可以通过圆形窗口和血液途径进入耳蜗。以前的研究表明，外周（腹膜内）接种CMV也可导致中枢神经系统和耳蜗感染[7]。CMV感染内耳的多种途径为研究CMV致聋建立动物模型提供了方法。目前，最常用于耳毒性研究的细胞模型是源自ImmortomouseTM内耳的OC-k3细胞系。OC-k3细胞不表达神经元标记，因此它们是毛细胞的假定前体细胞[8]。选择CMV感染小鼠耳蜗感觉上皮细胞（OC-k3细胞系）模型具有一定技术优势，其原代细胞的生物性状不会发生很大的改变，这一定程度上反映了它们在体内的状态，表现出原组织或细胞的特性。且原代细胞的基因表达分析能使研究者更好的理解生物学通路和疾病进程。

近年来，随着高通量测序及生物信息技术的迅猛发展，使得研究microRNA在听觉系统的发育和功能中的作用已经成为一个研究领域的热点。微小RNA（microRNA,miRNA）是小的非编码RNA，其通过RNA干扰（RNAi）途径发挥功能，并在转录后调节真核生物中的基因表达。miRNA在哺乳动物的内耳中表达丰富，并且某些miRNA在进化上与感觉细胞的发育和功能相关，miRNAs是内耳胚胎发育和出生后毛细胞命运维持所必需的[9]。自从1993年被发现以来，已鉴定出许多在内耳和外耳的正常发育中起作用的miRNA[10]。尽管已知miRNA影响细胞增殖，分化和形态发育，但尚未对其表达或在哺乳动物内耳发育中的作用进行论述。本研究拟通过筛选巨细胞病毒感染小鼠耳蜗感觉上皮细胞和正常小鼠耳蜗感觉上皮细胞差异表达的miRNA，以探索miRNA在mCMV感染小鼠耳蜗感觉上皮细胞中的作用及其调控机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系，病毒，及主要试剂

小鼠巨细胞病毒（mouse Cytomegalovirus，mCMV）Smith株来自中国医科大学病毒研究所，小鼠耳蜗上皮细胞（Mouse cochlear epithelial cells，MCEC）oc-k3细胞系购自于上海抚生生物技术有限公司。DEMD高糖培养基，胎牛血清，PBS等购自以色列BI公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，miRNA First-strand cDNA Synthesis，SuperMix Top qPCR SuperMix等miRNA反转录及荧光定量PCR试剂盒购自中国全式金生物公司。

1.2 细胞培养及病毒感染小鼠耳蜗上皮细胞模型的建立

MCEC细胞培养至能够稳定传代的细胞系L10代左右，将细胞铺于25CM2细胞培养瓶中，待其长满单层后，进行细胞饥饿12h，以使细胞同步化。以MOI=1接种小鼠巨细胞病毒，37℃孵育90分钟后，添加含2%FBS的MECE培养基继续培养72h，同步设置未接毒的MCEC细胞为对照组，并将实验组与对照组各进行三次生物学重复，于72h在普通光学显微镜及荧光显微镜下观察细胞病毒感染情况并记录。

1.3 总RNA的提取

将感染以及未感染72h的细胞样品用Trizol进行裂解，经过氯仿抽提，异丙醇沉淀，乙醇洗涤沉淀等过程对细胞总RNA进行提取，用分光光度计测量RNA的浓度，并用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，-80℃保存。

1.4 RNA小文库的构建及高通量测序

将经Trizol处理的感染72h（实验组）和未感染72h(对照组)的细胞样品，交由北京博奥晶典生物技术有限公司完成小RNA文库构建及高通量测序，检测病毒感染组及对照组miRNA表达的变化。

1.5 荧光定量PCR验证高通量测序结果

筛选差异表达明显的miRNA验证,筛选标准：根据测序结果，挑选差异表达倍数FC＞10,P＜0.01,已知和新发现的miRNA中上调最明显的miRNA各6个；差异表达倍数FC＞2,P＜0.01,已知和新发现的miRNA中下调最明显的miRNA各2个，进行验证。采用miRNA反转录试剂盒，对1.3中提取的细胞总RNA进行反转录反应，得到的cDNA用作荧光定量PCR的模板，选用RNU6基因作为内参，引物序列见表1，使用相对定量方法验证，计算结果基于2-△△ct法，所有实验进行三次生物学重复。

表1 miRNA实时荧光定量PCR引物序列Table 1 miRNA qPCR primer sequences

1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0对结果进行统计学分析。两组数据为非正态分布计量资料，采用非参数检验Mann-Whitney Test，P＜0.05为差异有统计学意义。用GraphPadPrism软件进行画图。

1.7 差异miRNA靶基因功能富集分析

我们基于miRNA和基因(mRNA)表达差异结果进行联合分析。对预测得到的miRNA的靶基因进行GO和KEGG富集分析，研究miRNA对于基因表达以及他在生物学进程的调控作用，同时还能对新预测的miRNA的调控功能做研究。

2 结果

2.1 mCMV感染与未感染72h的小鼠耳蜗上皮细胞

小鼠巨细胞病毒Smith株带有GFP-绿色荧光蛋白标签，可在荧光显微镜下观察其在细胞中的感染情况，见图1。mCMV感染72h时，处于病毒增长的指数期，此时细胞内病毒复制活跃细胞感染率较高。

图1 A为实验组mCMV感染小鼠耳蜗上皮细胞72h荧光显微镜下观察结果；B为mCMV感染小鼠耳蜗上皮细胞72h光学相差显微镜下观察结果，可见受感染的细胞变大，聚集，脱落、融合甚至损伤、死亡等出现细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)；C为对照组未感染的小鼠耳蜗上皮细胞72h相差显微镜下观察结果，细胞生长状态良好，未出现细胞病变效应。Fig.1 A shows the observation results of the cochlear epithelial cells of mice infected with mCMⅤin the experimental group under a 72h fluorescence microscope.B shows the observation results of the cochlear epithelial cells of mice with mCMⅤinfection in a 72h optical phase contrast microscope.Cytopathic effect(CPE)even appeared in injury and death.C is the observation result of 72h phase contrast microscope of uninfected mouse cochlear epithelial cells in control group,the cell growth was good,and no cytopathic effect appeared.

2.2 miRNA差异表达谱

根据小RNA文库测序比对结果，对感染及未感染mCMV 72h的小鼠耳蜗感觉上皮细胞差异表达的miRNA进行分析,筛选样本间差异表达的miRNA，采用显著性P值（P-value）和差异倍数（fold-Change，FC）作为差异表达的判断标准：（1）当P≤0.05，且FC≥2（log2(FC)≥ 1），判断为上调Upregulate；（2）当P≤ 0.05，且 FC≤0.5（log2(FC)≤ -1），判断为下调Down-regulate。其结果如图2所示，共检测到143个差异表达的miRNA，其中已知的miRNA有81个，新发现的miRNA有62个。已知的miRNA中共检测到69个上调的miRNA,12个下调的miRNA；新发现的miRNA中，共检测到46个上调的miRNA,16个下调的miRNA。

图2 显著性差异表达miRNA的火山分布图。A为已知差异表达的miRNA的火山分布图；B图为新发现差异表达的miRNA的火山分布图；图中每一个点代表一个miRNA，横坐标为fold-change值，纵坐标为显著性P-Value。红色标记为上调Up的miRNA，绿色标记为下调Down的miRNA。Fig.2 Ⅴolcanic distribution of significantly differently expressed miRNAs.A is the volcanic distribution of known differentially expressed miRNAs.B is the volcanic distribution of newly discovered differentially expressed miRNAs.Each point in the figure represents a miRNA,the abscissa is the fold-change value,and the ordinate is the significant P-Ⅴalue.Red marks are up-regulated miRNAs,and green marks are down-regulated miRNAs.

2.3 筛选差异表达显著的miRNA

筛选标准：测序结果中差异表达倍数FC＞10,P＜0.01,TOP6已知和新增上调的miRNA；测序结果中差异表达倍数FC＞2,P＜0.01,TOP2的已知和新增下调的miRNA，见表2。

2.4 qPCR验证差异表达明显的miRNA

对测序得到的差异表达的miRNA,我们对筛选差异表达明显的进行验证。qPCR结果显示，RNU6及miRNA产物熔解曲线均为单一曲线,反应特异。mCMV感染MCEC 72h后，验证8个已知的miRNA中，有6个与测序结果趋势一致，其中5个为上调，1个为下调趋势，见图3（A）；验证8个新发现的miRNA中，有4个与测序结果趋势一致，全部为上调趋势的miRNA，见图3（B）。miRNA的测序结果与qPCR结果趋势基本一致。表明，在mCMV感染MCEC过程中miRNA确实发生了差异表达，其中miR-7b-5p，miR-7a-5p的差异十分显著，上调约6倍左右，见表3,4，他们在病毒感染细胞的过程中可能发挥着重要的作用。

图3 差异表达的miRNA荧光定量PCR结果。A为差异表达的已知miRNA qPCR验证结果；B为差异表达的新发现miRNA qPCR验证结果；柱状图中每柱子代表经不同处理组处理的miRNA，黑色柱为病毒感染组的miRNA。灰色柱为对照组的miRNA。横坐标为miRNA的名称，纵坐标为miRNA相对表达量。n=3，*P＜0.05。Fig.3 Quantitative PCR results of differentially expressed miRNAs.A is the differentially expressed known miRNA qPCR verification results.B is the differentially expressed new miRNA qPCR verification results.Each bar in the histogram represents the miRNA treated by a different treatment group,black bars are miRNAs from the virus-infected group,the gray bar is the miRNA of the control group.The abscissa is the name of the miRNA and the ordinate is the miRNA relative Expression.n=3,*P＜0.05.

表2 筛选差异表达明显的miRNATable 2 Screen for differentially expressed miRNAs

2.5 差异表达miRNA靶基因的富集分析

为了解这些差异表达miRNA的功能，我们对测序结果得到的差异表达的miRNA靶基因进行功能富集分析。如图4所示，图中按富集程度列出最靠前的三十个分类项，分析显示：多数差异性表达的miRNA的功能主要参与细胞、生物过程的调控，新陈代谢的调控，以DNA为模板转录，RNA合成等生物学过程；主要作为细胞内，核质等细胞成分；主要行使离子结合等分子功能。通过KEGG分析，如图5所示:这些差异miRNA主要参与了感觉系统，免疫系统，病毒传染，信号转导等的信号通路。

图4 miRNA靶基因的GO富集图。图中横坐标表示富集结果中注释到该Term的输入的差异基因数目与注释到该Term的背景基因数目的比值，该比值越大表示富集程度越大。颜色代表Corrected P-Value/P-Value，该值越小表示该条term富集越可靠。圈的大小代表富集结果中的注释到该Term的输入的差异基因数目，其值越大，圈越大。Fig.4 GO enrichment map of miRNA target genes.The abscissa in the figure represents the ratio of the number of differential genes annotated to the Term input to the number of background genes annotated to the Term in the enrichment result.The larger the ratio,the greater the degree of enrichment.The color represents Corrected P-Ⅴalue/P-Ⅴalue.The smaller the value is,the more reliable the term enrichment is.The size of the circle represents the number of differential genes from the annotation in the enrichment result to the input of the Term.The larger the value,the larger the circle.

表3 荧光定量PCR验证实验组和对照组中已知miRNA相对表达量Table 3 Relative expression levels of know miRNA in the experimental group and the control group by qPCR

表4 荧光定量PCR验证实验组和对照组新发现的miRNA相对表达量Table 4 Relative expression levels of novel miRNA in the experimental group and the control group by qPCR

图5 miRNA靶基因的KEGG分类图。图中横坐标为所富集到的lncRNA靶基因数目，纵坐标为基因功能分类条目，每一种颜色代表不同的分类类别。Fig.5 KEGG classification of miRNA target genes.In the figure,the abscissa is the number of lncRNA target genes that are enriched,and the ordinate is the gene function classification entry.Each color represents a different classification category.

3 讨论

miRNA是一类内源性18-24核苷酸（nt）非编码RNA，它们具有转录后调节功能。大量的研究表明，miRNA参与多种生理过程，包括发育，细胞凋亡和脂肪代谢的调节。它们也被证明与肿瘤和病毒感染的建立和发展相关[11-13]。

在本研究中，我们首先构建mCMV感染小鼠耳蜗感觉上皮细胞的模型，用高通量测序技术来检测mCMV感染小鼠耳蜗感觉上皮细胞后，处于病毒指数增长期72小时时miRNA变化的情况，通过测序发现差异表达的miRNA，进而通过对测序结果进行筛选，用qPCR验证得到与测序结果趋势一致的6个已知miRNA，4个新发现的miRNA。

经qPCR验证，与测序结果趋势一致的10个miRNA中，miR-7b-5p和miR-7a-5p的差异表达较为明显，他们在病毒感染细胞的过程中可能发挥着重要的作用，值得深入研究。利用miRanda软件对这两个miRNA进行miRNA-Target预测,其中miR-7b-5p 的靶基因 Plpp5，Tcf12，S1pr2，Atrx，Shpk，Luc7l等得分较高，miR-7a-5p的靶基因Cbx4，Shpk，Plpp5，2210011C24Rik等得分较高。通过对他们的靶基因进行GO功能显著性富集分析，结果显示，这两个miRNA在生物学功能上主要参与代谢过程，细胞过程，生物调节过程，以及对刺激的反应。在细胞成分上主要是构成膜，大分子复合物，细胞器部分等。在分子功能上主要行使核酸结合转录因子活性，分子换能器活性，催化活性等分子功能。在KEGG信号通路分析中，发现这些miRNA的靶基因主要参与神经活性配体-受体相互作用，鞘脂信号通路，氧化应激诱导衰老，细胞对压力的反应等信号通路。以往研究表明,CMV诱发SNHL与耳蜗细胞炎症反应有关，CMV感染可引起炎症小体在小鼠内耳组装，这些炎性因子具有神经毒性，可能会导致听力受损[14]。而本研究中发现差异表达的miRNA靶基因也与免疫系统的信号通路有关。此外又有研究表明，由MCMV感染引起的听力下降可能与活性氧ROS引起的炎症有关，MCMV可通过在小鼠耳蜗和培养的SGN中产生ROS来激活NLRP3炎性体[15]，而本研究中对经qPCR验证的两个差异表达明显的miRNA靶基因功能富集分析中显示他们参与氧化应激诱导衰老的信号通路。从而可以推测这些差异表达的miRNA可以通过免疫反应，氧化应激等相关通路在CMV致聋的过程中发挥出重要的作用。由此可见，这些差异表达的miRNA在巨细胞病毒感染小鼠耳蜗感觉上皮细胞中行使了十分重要的生物学功能。病毒与宿主之间以miRNA为介质相互拮抗。病毒为了利于复制，而宿主细胞为了对抗病毒感染，他们利用miRNA作为调控分子相互协调，形成了一张复杂的调控网络,在转录调控,信号转导,过程凋亡等途径中发挥了重要的作用。

高通量测序技术的飞速发展为非编码RNA的系统研究提供了一个快速可靠的平台。高通量测序技术具有高通量和低单碱基成本的特点,但是测序读长相对较短是第二代测序技术的主要缺陷[16]。高通量测序技术同时也存在着分析质量的把控，主要包括比对质量、组装质量以及预测miRNA时产生的假阳性等问题。因此，我们通常需要对高通量测序的结果采用另一技术平台实时荧光定量PCR技术进行验证，由于高通量测序技术与实时荧光定量PCR技术是不同的技术平台，测序也存在一定的错误率，随着错误的积累，最终导致表达量出现一定程度的偏差。在本研究中，挑选验证的miRNA存在一定比例的低表达，即测序结果表达量读数值RawRC偏低，这在一定程度上会使验证结果的总体吻合率降低，而从本次研究的结果来看，验证结果的总体吻合率达到60%以上，基本可以确定测序结果的可靠性。尽管越来越多的学者通过高通量测序技术来研究非编码RNA，但是转录组学的研究尚处在起步阶段，特别对于miRNA的调控机制，仍然面临着诸多问题与挑战。但是随着未来测序技术和生物信息学的发展，miRNA在巨细胞病毒感染耳聋过程中的作用机制终将被人们所挖掘。

4 结论

综上所述，本研究应用高通量测序检测出mCMV感染MECE72h时miRNA的差异表达，筛选并验证出差异表达明显的miRNA，利用生物信息学技术对差异表达的miRNA所具有的生物学功能以及可能参与的信号通路进行预测，从分子水平为探讨CMV感染导致耳聋发生发展机制提供了新的研究方向，为近一步研究CMV感染导致耳聋的发生机制提供了有意义的信息。