吡非尼酮对内皮细胞间质转化的抑制作用及机制

廖丁莹，付丽丽，郑玉萍，王丽君，李宏松，张文怡，王建明，赵 琳

0引言

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)是一种常见的视网膜变性疾病，主要发生于50岁以上的中老年人群。近20a来，ARMD的患病率已经达到8.7%[1]。湿性ARMD是以黄斑区脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)为主要特点，异常的新生血管会引起出血和渗出，使黄斑部感光细胞功能减退，甚至造成纤维瘢痕化和视网膜脱离，视力永久性丧失[2]。目前一线治疗方法为玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子(VEGF)类药物治疗，抑制或减少新生血管的形成及出血渗出。但是随着该类药物的广泛应用和随访时间的延长，视网膜下纤维化逐渐加重的情况日益突显。有文献指出在CNV疾病中，血管内皮细胞是新生血管和纤维化过程中多因素作用的关键细胞，脉络膜微血管内皮细胞符合内皮细胞的特有表型[3]。内皮细胞在各种刺激因子的作用下，其内皮特性逐渐消失而转化为间质细胞(endothelial-to-mesenchymal transition，EndoMT)，最终导致纤维化，形成视网膜下瘢痕[4]。目前普遍认为缺氧会使转化生长因子-β(TGF-β)水平升高，TGF-β又是刺激EndoMT发生的最常见的因子，同时也会引起下游纤维化因子增多[5]，进一步加重视网膜下纤维化的程度。

吡非尼酮(Pirfenidone，PFD)是一种新型的广谱抗纤维化小分子化合物，其主要作用靶点是TGF-β，可有效抑制纤维细胞增殖和细胞外基质沉积[6]，已成为治疗肝、肾及心肌纤维化的一线药物。但PFD是否能够延缓CNV患者视网膜下纤维化的进展尚未见报道。本研究初步观察PFD对缺氧诱导内皮细胞EndoMT过程的抑制作用及机制，探讨PFD延缓视网膜下纤维化的可行性。

1材料和方法

1.1主要试剂和仪器M199培养基(Gibco)，胎牛血清(BI)，内皮细胞生长因子(ScienCell)，吡非尼酮(Sigma)，CoCl2(Sigma)，CCK-8(索莱宝)，Trizol(Invitrogen)，反转录和PCR试剂盒(TaKaRa)，PCR引物(生工)，BCA蛋白定量试剂盒(赫特)。电泳仪、电转仪和发光仪(Bio-Rad)，实时荧光定量PCR仪(Step One Plus)；荧光成像显微镜(Zeiss)。

1.2方法

1.2.1原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分离及培养标本取自于西安交通大学第二附属医院妇产科正常剖宫产的新生儿无菌脐带，约25～30cm，置于无菌保存液中转运。本研究标本取材获得西安交通大学第二附属医院伦理委员会审批[No.(2019)伦审-研第(021)号]。在超净台内用灭菌PBS缓冲液反复冲洗脐静脉内部以除去凝血块及残留物，预热至37℃的0.1% Ⅰ型胶原酶10mL灌入脐静脉内，夹闭脐带两端，37℃消化10min，期间不时地晃动脐带使胶原酶Ⅰ充分接触静脉内壁。消化结束后回收消化液至离心管内，室温下800×g离心5min得到脐静脉内皮细胞，加入含20%胎牛血清的M199培养基，吹打混匀种于培养皿内，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，24h后换液。待内皮细胞生长融合至80%～90%时，用0.05%胰蛋白酶消化传代，经vWF因子抗原实验鉴定确认原代细胞分离成功，选第4～7代细胞用于后续实验。

1.2.2原代HUVECs鉴定免疫荧光法检测vWF因子抗原。将细胞均匀接种于置有灭菌爬片的24孔板内，生长至约50%时，PBS缓冲液清洗后加入4%多聚甲醛冰上固定30min，PBS缓冲液洗涤后加入0.1% Triton-X100溶液，室温破膜20min，小牛血清室温封闭1h，加入兔抗人vWF因子抗体(Abcam，ab154193，1∶300)，4℃过夜，再加入488nm荧光素标记的羊抗兔二抗(CST，#4412，1∶800)室温孵育1h，DAPI室温作用20min后，在荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖活力将细胞每孔100μL均匀接种于96孔板中，根据参考文献[7]的浓度梯度，待细胞贴壁后加入不同浓度PFD(0、0.01、0.1、0.3、0.6、0.9mg/mL)或CoCl2(0、25、50、100、200、400、800μmol/L)，分别孵育不同时间(12、24、48h)后，每孔加入10μL CCK-8工作液，培养箱内孵育4h，取出后测定各孔在450nm处的吸光度(OD)值，计算细胞增殖率，细胞增殖率=(OD实验组-OD空白)/(OD对照组-OD空白)×100%，筛选出合适的药物浓度和作用时间。

1.2.4实验分组将细胞随机分为4组：(1)正常对照组：不含CoCl2和PFD的无血清培养基培养细胞24h；(2)CoCl2模型组：含200μmol/L CoCl2的无血清培养基培养细胞24h；(3)CoCl2+低浓度PFD组：含0.3mg/mL PFD的无血清培养基预处理1h，再用含200μmol/L CoCl2和0.3mg/mL PFD的无血清培养基共同培养细胞24h；(4)CoCl2+高浓度PFD组：含0.6mg/mL PFD的无血清培养基预处理1h，再用含200μmol/L CoCl2和0.6mg/mL PFD的无血清培养基共同培养细胞24h。收集细胞用于后续实验。

1.2.5 Western blot实验检测蛋白质相对表达量收集各组细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度，与上样缓冲液混合后高温煮10min。在聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中电泳，使用湿转的方法将蛋白质转移至激活的PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1h。按照目标蛋白的分子量裁膜，分别加入上皮标志物CD31(Santa Cruz，sc-376764，1∶500)、VE-cadherin(Abcam，ab33168，1μg/mL)，纤维细胞标志物α-SMA(Abcam，ab5694，1μg/mL)、FSP1(Abcam，ab197896，1∶1000)，通路因子p-p38(ABclonal，AP0057， 1∶1000)、p38(ABclonal，A4771，1∶1000)和内参GAPDH(Proteintech，60004-1-lg，1∶25000)抗体，4℃过夜，TBST洗膜后分别加入羊抗兔(Elabscience，E-AB-1003，1∶3000)、羊抗鼠(Elabscience，E-AB-1001，1∶3000)二抗，室温孵育1h，洗膜后加入ECL显色液后曝光拍照。

图1 原代HUVEC细胞的形态及鉴定 A：光镜(×40)；B：光镜(×100)；C：vWF因子荧光染色(×200)。

1.2.6细胞免疫荧光双染法检测蛋白表达情况细胞随机均匀种于铺有无菌爬片的24孔板中，贴壁后各组分别加入相应药物进行干预，24h后4%多聚甲醛冰上固定30min，PBS缓冲液洗涤后加入0.1% Triton-X100溶液，室温破膜20min，小牛血清室温封闭1h，滴加鼠抗人CD31(Abcam，ab24590，1∶150)和兔抗人α-SMA(Abcam，ab5694，1∶100)混合抗体，4℃过夜，洗涤后分别滴加种属对应的594nm(Proteintech，SA00013-3，1∶250)和488nm(CST，#4412，1∶800)荧光二抗，避光室温孵育1h，洗涤后DAPI避光染色20min，洗涤后封片。镜下拍照观察。

1.2.7细胞划痕实验观察细胞迁移能力预先在六孔板背面画出定位线，细胞随机均匀种于各孔，贴壁后用200μL枪头垂直于定位线画出划痕，按照分组分别加入相应药物进行干预，每孔于划痕后0、24h在显微镜下观察并拍照。细胞迁移率=(0h划痕距离-24h划痕距离)/0h划痕距离×100%。

1.2.8实时定量q-PCR检测mRNA含量按各个分组进行培养干预后收集细胞，使用Trizol法提取细胞总RNA，分光光度计测定纯度和浓度后，逆转录为cDNA，采用20μL体系进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性2min，1个循环，94℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸20s，循环40次。TGF-β1引物序列：5’-CAGCAACAATTCCTGGCGATA-3’，5’-GCTAAGGCGAAAGCCCTCAAT-3’；SNAI1引物序列：5’-TCGGAAGCCTAACTACAGCGA-3’，5’-AGATGAGCATTGGCAGCGAG-3’；β-actin引物序列：5’-TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC-3’，5’-GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3’。反应结束后根据扩增曲线结果，采用2-ΔΔCt法计算各目标基因的相对表达量。

统计学分析：本实验的统计学分析采用SPSS 25.0软件进行。所有实验均重复3次。计量数据用均数±标准差表示，各组之间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1原代HUVECs细胞鉴定接种24h后，镜下可见内皮细胞贴壁，呈梭形或椭圆形，边界清晰。第4～6d，内皮细胞单层生长融合成片，排列紧密的部分呈典型的铺路鹅卵石样(图1A、1B)。荧光显微镜下可见内皮细胞胞浆内均有亮度较强的绿色荧光，说明人vWF因子存在于细胞内，证明上述方法分离HUVECs细胞成功，且纯度可达95%以上，可用于后续实验(图1C)。

2.2不同浓度CoCl2和PFD对HUVECs的增殖活力影响

筛选CoCl2诱导缺氧建立纤维化模型的最佳作用时间和浓度。结果如图2A所示，随着CoCl2作用时间和浓度的增加，细胞的增殖率逐渐下降，24h时各组细胞的增殖活力均在50%左右，对照组、25、50、100、200、400、800μmol/L CoCl2组的增殖率分别为(100±0)%、(83.48±9.11)%、(79.52±10.00)%、(69.72±11.78)%、(59.05±7.40)%、(44.75±10.69)%、(38.17±4.97)%，各组之间差异有统计学意义(F=39.52，P<0.01)。与对照组相比，100、200、400、800μmol/L组差异有统计学意义(t=6.298、13.56、12.66、30.54，均P<0.001)，表明CoCl2会导致内皮细胞缺氧，降低增殖率，具有一定的浓度依赖性。200μmol/L CoCl2干预细胞24h后增殖率略大于50%，故本实验使用200μmol/L CoCl2刺激细胞24h建立细胞模型。

筛选PFD最佳治疗时间和浓度。结果如图2B所示，不同时间不同浓度PFD组分别与对照组、DMSO组相比，细胞增殖率基本不受影响(F12h=0.418，F24h=0.289，F48h=0.240，均P>0.05)，表明使用DMSO溶解PFD不会产生细胞毒性，且单纯使用PFD不会对内皮细胞增殖产生影响。

图2 CoCl2和PFD对内皮细胞增殖率的影响 A：CoCl2对细胞增殖率的影响(a P<0.05，b P<0.01 vs 对照组)；B：PFD对细胞增殖率的影响；C：PFD对缺氧条件下细胞增殖率的影响(b P<0.01 vs 对照组；d P<0.01 vs 单纯缺氧组)。

不同浓度PFD预处理内皮细胞1h后，再加入200μmol/L CoCl2，使其共同干预刺激细胞24h，结果如图2C所示，对照组、单纯缺氧组、0.01、0.1、0.3、0.6、0.9mg/mL PFD组细胞增殖率分别为(100±0)%、(60.81±5.23)%、(59.4±5.90)%、(60.81±7.23)%、(72.45±6.30)%、(75.85±6.21)%、(79.7±4.94)%，差异有统计学意义(F=13.1，P<0.001)。与对照组相比，单纯缺氧组细胞增殖率降低(t=13.8，P<0.001)；与单纯缺氧组相比，经0.3、0.6、0.9mg/mL PFD溶液预处理后细胞增殖率明显增加，差异有统计学意义(t=3.478、4.534、6.427，均P<0.01)。故后续实验使用200μmol/L CoCl2和0.3、0.6mg/mL PFD共同干预细胞。

2.3 PFD对缺氧诱导的EndoMT过程中细胞迁移能力的影响各组细胞迁移率分别为(100±5.34)%、(332.63±10.37)%、(183.97±13.27)%、(204.75±9.40)%，差异有统计学意义(F=129.4，P<0.001)。正常对照组细胞形态规则，24h后划痕边缘整齐光滑，仍清晰可见；CoCl2模型组细胞划痕边缘在24h时基本消失，细胞向划痕区域迁移，状态不佳，变形及死亡的细胞数量增多；CoCl2模型组与正常对照组相比，缺氧后内皮细胞迁移能力增加(t=38.87，P=0.0007)。经低浓度或高浓度PFD溶液预处理后，两组细胞的形态较CoCl2模型组改善，两组间细胞迁移率差异无统计学意义(t=3.369，P=0.078)，但与模型组对比迁移率均明显减小(t=88.41、16.29，均P<0.01)。证明PFD可抑制缺氧对内皮细胞迁移运动的增强作用(图3)。

2.4 PFD对缺氧诱导的EndoMT过程中各标志物蛋白及mRNA表达的影响PFD可抑制EndoMT过程中间质细胞标志蛋白的表达和增加内皮细胞标志蛋白的表达。与正常对照组相比，CoCl2模型组细胞的α-SMA、FSP1的蛋白表达水平显著升高(t=5.328、4.706，均P<0.05)，CD31、VE-cadherin的蛋白表达水平降低(t=6.379、5.78，均P<0.05)；与CoCl2模型组比较，低浓度PFD组和高浓度PFD组均能显著抑制α-SMA、FSP1的蛋白表达，使CD31、VE-cadherin的蛋白表达仍维持在一个较高的水平(均P<0.05)，但组间差异无统计学意义(均P>0.05)，见图4，表1。

PFD可抑制EndoMT过程中转录因子及通路因子的表达。与正常对照组相比，CoCl2模型组中p-p38磷酸化蛋白被激活(t=7.382，P<0.05)，经高低浓度PFD干预后，p-p38蛋白的磷酸化过程被抑制(t=4.667、9.392，均P<0.05)，p38总蛋白含量不变(P>0.05)，图5A、5B，表1。

q-PCR实验结果显示，CoCl2模型组细胞中TGF-β1、转录因子SNAI1 mRNA含量较正常对照组明显升高(t=14.46、9.89，均P<0.05)；与CoCl2模型组相比，低浓度和高浓度PFD组能明显抑制TGF-β1、转录因子SNAI1 mRNA转录(均P<0.05)，且两组间差异无统计学意义(均P>0.05)，见表2，图5C。

细胞免疫荧光双染检测结果显示，各组细胞CD31和α-SMA的表达差异具有统计学意义(F=105.6、33.42，均P<0.001)。与正常对照组相比，CoCl2模型组细胞CD31红色荧光强度显著变弱(t=18.02，P<0.01)，α-SMA绿色荧光强度增加(t=24.26，P<0.01)；与CoCl2模型组比较，低浓度和高浓度PFD组细胞α-SMA绿色荧光强度均被抑制(t=7.403、4.935，均P<0.05)，CD31红色荧光强度增加(t=10.09、4.394，均P<0.05)；低浓度和高浓度PFD组相比，α-SMA和CD31荧光强度无明显差异(t=1.021、1.152，均P>0.05)，见图6。

图3 PFD对缺氧条件下内皮细胞迁移能力的影响 A：光镜下各组迁移距离的测量(×40)；B：各组迁移率的定量分析。b P<0.01 vs 正常对照组；d P<0.01 vs CoCl2模型组。

图4 PFD对缺氧条件下内皮细胞EndoMT过程中相关标志蛋白表达量的影响 A：内皮细胞标志因子(CD31、VE-cadherin)和间质细胞标志因子(α-SMA、FSP1)的蛋白表达检测条带；B：各标志因子蛋白表达的定量分析。a P<0.05 vs 正常对照组；c P<0.05 vs CoCl2模型组。

表1 各组细胞中CD31、VE-cadherin、α-SMA、FSP1、p-p38和p38蛋白条带灰度值

表2 各组细胞中TGF-β1和SNAI1 mRNA表达情况

3讨论

眼底新生血管性疾病对视力产生影响的原因主要有活动性新生血管的出血渗出和新生血管萎缩后形成的纤维化组织。目前抗VEGF治疗主要针对的是减少新生血管的生成及出血渗出，而对血管萎缩后的纤维化改变关注较少。Pedrosa等[8]对接受抗VEGF连续治疗的ARMD患者展开60mo的随访观察，发现有55.69%的随访者出现了较严重的黄斑部视网膜下纤维化。虽然纤维化是新生血管的必然结局，但是多次抗VEGF治疗会破坏血管新生和纤维化之间的平衡，和自然病程共同引起过度的纤维增殖[9]。多项研究证实在各种因素刺激下，内皮细胞可通过TGF-β、Notch、Wnt等信号通路在心脏、肺和肾组织中发生EndoMT[10]。目前视网膜下纤维化的研究多集中于视网膜色素上皮细胞的上皮间质转化(EMT)，而脉络膜微血管内皮细胞的内皮间质转化(EndoMT)则关注较少。

图5 PFD对缺氧条件下内皮细胞EndoMT过程中转录因子及通路因子表达的影响 A：通路标志因子(p38、p-p38)的蛋白表达检测条带；B：p38、p-p38蛋白表达的定量分析；C：通路标志因子TGF-β1和转录因子SNAI1 mRNA表达的定量分析。a P<0.05，b P<0.01 vs 正常对照组；c P<0.05，d P<0.01 vs CoCl2模型组。

图6 PFD对缺氧条件下内皮细胞中CD31和α-SMA表达的影响 A：各组细胞CD31和α-SMA的免疫荧光双染结果(×200，CD31为红色荧光，α-SMA为绿色荧光)；B：CD31和α-SMA的免疫荧光强度定量分析。b P<0.01 vs 正常对照组；c P<0.05，d P<0.01 vs CoCl2模型组。

缺氧是导致ARMD疾病发展的一个重要因素，缺氧会促进新生血管的发生，而血管的生长则使缺血进一步加重，使脉络膜微血管内皮细胞进入EndoMT过程，引起视网膜下纤维瘢痕形成，所以寻找抑制视网膜下纤维化的方法显得尤为重要。由于人脉络膜微血管内皮细胞很难获得，HUVECs是从人脐带静脉血管中分离培养的原代细胞，是研究新生血管及其后期进展的重要体外细胞模型，在视网膜及脉络膜新生血管的研究中也广泛应用[11]，故本研究使用HUVECs作为细胞模型。首先，本研究利用CoCl2诱导内皮细胞缺氧，建立纤维化模型。实验中观察到内皮细胞在缺氧环境中迁移能力增强，形态由铺路鹅卵石样逐渐变为狭长梭形，细胞之间的紧密连接变松散，间隙增大，内皮细胞标志物CD31和VE-cadherin表达减少，间质细胞标志物α-SMA和FSP1表达增多，说明该缺氧模型可以成功诱导EndoMT的发生。

既往研究证实PFD在肾、肺和肝脏等器官中可以减少促纤维和促炎症因子的分泌和表达，如TGF-β、TNF-α，从而抑制细胞的间质转化和胶原蛋白产生[12]。眼部的新生血管形成和纤维化均与TGF-β有关[13]。Martin等[14]学者发现患者接受抗VEGF药物治疗后，玻璃体腔中TGF-β含量增加，与后期纤维化显著相关。本研究通过CCK-8法检测了不同浓度PFD对内皮细胞增殖的影响，结果显示PFD可明显抑制缺氧细胞的增殖，其浓度为0.3、0.6和0.9mg/mL时均有效果，且组间无明显差异，考虑到0.9mg/mL浓度较高，可能会引起药物副作用，故后续实验药物浓度选择0.3、0.6mg/mL。实验中各浓度PFD对正常内皮细胞的增殖无明显影响，主要是因为在正常视网膜脉络膜组织中，TGF-β处于无活性的“潜活状态”，当视网膜脉络膜组织受到缺血、缺氧、炎症等损伤时，可以激活TGF-β[15]，使其可以发挥促进纤维细胞增殖、减少细胞外基质降解等纤维化改变，此时PFD可以有效抑制这些生物学效应。

本研究对缺氧诱导的内皮细胞给予PFD治疗后，光镜下观察治疗组的细胞形态比单纯缺氧组的形态更圆润，细胞间隙较小，细胞边缘突起减少，比较接近正常内皮细胞的形态。通过划痕实验可以观察到PFD组的细胞迁移能力较单纯缺氧组弱。与单纯缺氧组相比，PFD组的内皮细胞标志物CD31和VE-cadherin的蛋白质表达增多，间质细胞标志物α-SMA和FSP1的蛋白质表达减少。上述改变在高低浓度PFD组间没有显著差异。由此证实了PFD可抑制内皮细胞向纤维细胞转化的EndoMT过程，且该抑制作用对PFD浓度的差异不敏感，可以说明0.3～0.6mg/mL均为细胞治疗窗，PFD的有效浓度范围较大，该有效浓度与Guo等[7]报道的用于抑制Tenon囊成纤维细胞增殖迁移时的浓度相同。

近年来，TGF-β/Smad通路被认为是促进纤维化的经典信号通路。除此之外，多种Smad非依赖性信号通路可以被TGF-β激活[16]。Choi等[17]验证了PFD通过TGF-β/Smad通路抑制纤维化的发生。有研究已经证明TGF-β能够通过p38 MAPK信号通路促进眼部各组织多种细胞的新生血管生长和瘢痕化[18]。本研究发现缺氧的内皮细胞中TGF-β1和转录因子SNAI1 mRNA转录水平显著增高，p-p38磷酸化蛋白被激活，而加入PFD干预后可以抑制这些因子的转录增加以及p-p38磷酸化蛋白的激活，初步提示PFD抑制EndoMT过程是通过TGF-β/p38 MAPK通路进行的，这对PFD可以延缓视网膜下纤维化的效果及机制提供了更充分的理论依据。

综上所述，PFD可以有效抑制内皮细胞纤维化的进展，TGF-β/p38 MAPK通路可能是PFD调控内皮细胞向纤维细胞转化EndoMT过程的机制之一，这可以成为PFD抗视网膜下纤维化的理论基础，但该作用在眼内的实际效果，则需要更进一步的动物实验论证。