细胞自噬在甲状腺相关眼病中的作用

袁善思，刘 薇，马 超，陈 兰，李凯军

0引言

甲状腺相关眼病(thyroid-associated ophthalmopathy，TAO)，又称Graves眼病，是一种可导致眼外肌、眼眶脂肪和结缔组织炎症的自身免疫性疾病[1]，是目前临床上最常见的眼眶疾病[2]。其主要的临床表现为眼球突出、暴露性角膜炎、特征性的眼睑征及视神经压迫等多方面，严重者可致盲[3]。TAO的发病机制极为复杂，其发病机制尚未完全阐明。有学者认为其发病机制主要涉及以下三个方面：炎症、脂肪形成和糖胺多糖(glycosaminoglycans,GAG)聚集[4]。自噬存在于细胞内，它既是维持细胞正常生理学功能的基础，也是细胞面对内外微环境刺激或压力的一种防御方式[5]，具有非选择性。自噬是一把双刃剑，适当水平的自噬可以帮助机体抵御外部压力，如机体通过在饥饿、化疗、感染、衰老和缺氧等环境下提高细胞自噬水平来保护机体免受伤害，但过高的自噬水平则会使病情恶化，引起机体损伤[6]。自噬介导了细胞成分的降解，维持细胞内稳态所需的营养，促进细胞成分循环利用[7]。本文主要讨论在TAO疾病中产生过度的自噬水平对疾病的影响。有研究表明[8-10]，自噬水平的升高在TAO的发生发展中起着重要作用，可导致眼眶炎症增强、脂肪形成增多和GAG聚集。而适当降低自噬，可减弱眼眶炎症、减少脂肪形成和GAG聚集，从而缓解TAO的发展。现将从眼眶炎症、脂肪形成和GAG聚集三个方面讨论自噬在TAO中的作用。

1自噬在TAO中的作用

自噬是一种高度保守的分解代谢过程，宿主细胞可以通过溶酶体降解蛋白质聚集物和受损的细胞器来维持细胞的稳态[11]。细胞发生自噬后，细胞浆中出现大量游离的膜性结构，称为前自噬泡。前自噬泡逐渐发展，成为由双层膜结构构成的空泡,包裹变性坏死的细胞器和部分细胞浆,这种双层膜被称为自噬泡。自噬泡的外膜与溶酶体膜融合后,内膜及其包裹的物质进入溶酶体,被溶酶体中的酶水解[12]。目前已研究出自噬有3种类型：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬，其中巨自噬为最主要的类型。巨自噬形成具有特殊结构的自噬小体，以捕获细胞内容物和目标蛋白。随后，捕获的细胞内容物和目标蛋白被包裹在自噬小体的胞质双膜递送囊泡中。接下来，自噬小体随后与溶酶体融合，将内容物分解成可回收利用的大分子成分[13]。自噬途径的调控主要包括三个大分子复合物：哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin,mTOR)复合物、类UNC-51自噬激活蛋白激酶1(unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)复合物和Beclin 1/PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)经典复合物(图1)[14-16]。

研究表明[17]，自噬在TAO患者中的表达水平较非TAO患者高，且在甲状腺相关眼病的发生发展中起着重要作用。IL-1β可以导致眼眶成纤维细胞中炎症因子增加，而这种IL-1β引起的炎症伴随着自噬活动的增加，导致自噬相关蛋白Beclin-1和Agt-5表达增加，LC3-I到LC3-Ⅱ的转化增强[8]。自噬也可以根据环境调节炎症细胞因子的产生和分泌，如IL-6、IL-8、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)和I型干扰素等[18]。长期的炎症环境可导致胶原蛋白和糖胺聚糖沉积，导致组织扩张和纤维化[10]。除此之外，大量研究[19-21]表明自噬也参与脂肪形成。自噬水平增高会促进脂肪分化，异常增生的脂肪组织可直接导致眼眶压力增高，眼球突出，不仅如此，脂肪组织还可作为一种新的内分泌器官，分泌多种脂肪细胞因子、生长因子及蛋白分子等，其中部分因子可能参与了TAO的发病过程[22]。因此，自噬在TAO的发生发展中起着十分重要的作用，对自噬进行合理的调节或可缓解TAO进程。

1.1自噬对TAO中炎症的影响在TAO的发生发展过程中，T细胞在抗原的刺激下不断地进行迁徙并高度增殖，分化成多种多样的效应T细胞，如CD4+辅助T细胞(Th1/Th2/Th17)、CD8+T细胞、调节性T细胞(Treg细胞)等。T细胞通过双重信号识别抗原并活化自身，活化后的T细胞分化形成效应T细胞发挥作用。Th1细胞因子在TAO早期起主导作用，促进了从早期炎症向晚期慢性炎症的过渡，晚期则出现Th2细胞因子富集[23]。除此之外，TAO患者的眼眶成纤维细胞可分泌IL-6、IL-8等炎症因子，其炎症因子的分泌水平明显比正常患者高；成纤维细胞与Th17细胞的相互作用促进了成纤维细胞的炎症反应，而且它还能吸引Th17细胞，导致TAO的进一步恶化[24]。因此，炎症在TAO的发病过程中起着重要作用。有研究表明[25]，自噬是控制免疫性炎症的关键因素。Li等[8]研究表明，IL-1β刺激可引起眼眶成纤维细胞炎性细胞因子如图1自噬通路图。

IL-6、TNF-α、MCP-1的mRNA表达增加，这种IL-1β引起的炎症伴随着自噬水平的升高，自噬相关蛋白Beclin-1和Agt-5表达增加，LC3-I向LC3-Ⅱ转化增多；用自噬抑制剂3-MA bafilomycin A1处理眼眶成纤维细胞，或沉默自噬相关蛋白Beclin-1、Atg-5可减弱IL-1β诱导的眼眶炎症，而自噬激活雷帕霉素则导致眼眶成纤维细胞炎症增强，该研究表明自噬水平与眼眶成纤维细胞的炎症水平呈现相同的变化趋势，黄芪甲苷Ⅳ可通过抑制自噬减弱TAO患者眼眶炎症。因此，对自噬的合理调控可以减弱TAO患者眼眶炎症，缓解疾病进程。

1.2自噬对TAO中脂肪形成的影响脂肪形成是TAO发病机制的重要过程，Nishida等[26]测量了TAO患者和正常人的眼眶，发现TAO患者的眼眶组织容量较正常人显著增加，且眼眶脂肪组织的增加量明显大于眼外肌的增加量，并在一定程度上决定了眼球的突出程度。不仅如此，脂肪组织还可作为一种新的内分泌器官分泌细胞因子，部分可能参与了TAO的发病过程[22]，因此，脂肪形成是TAO的重要发病过程。脂肪细胞的形成是一个多阶段的过程，涉及前脂肪细胞的增殖、生长停滞和终末分化，是前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化过程[27]。大量研究[19-21]表明脂肪形成的过程需要自噬参与。电镜显示，自噬体在脂肪分化的早期和中期大量形成，最终消失，细胞形态由长梭形变为球形，分化的后期，细胞质内形成脂滴[17]。动物实验也表明：特异性敲除自噬基因atg5或atg7在白色脂肪组织中的表达可导致突变小鼠脂肪细胞形态异常、脂肪沉积减少[19-21]，通过对3T3-L1前脂肪细胞和小鼠胚胎成纤维细胞的体外研究也证明从遗传和药理学等方面抑制自噬可阻断脂肪细胞分化，例如淫羊藿苷可通过抑制AMPK/mTOR通路的激活来抑制自噬，从而抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化。Li等[8]研究表明用自噬抑制剂处理，或沉默自噬相关蛋白Beclin-1和Atg-5，可显著减少体外眼脂肪积聚、胶原沉积和体内巨噬细胞浸润。

1.3自噬对TAO中GAG聚集的影响在众多导致TAO患者眼球突出的因素中，GAG的聚集也是其重要原因之一[28]。根据其化学结构，GAG为重复的二糖单元组成的线性多糖，其以游离形式以透明质酸的形式存在，或者共价连接到蛋白多糖上。GAG的组成具体包括透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)、硫酸乙酰肝素和肝素[29]。炎症浸润学说认为，炎症介质如IL-1、TNF-α、IFN-γ、TGF-β、IGF-1、PDGF(血小板衍生生长因子)和前列腺素可刺激眼眶成纤维细胞产生HA[28]。机械致病机制认为，TAO发病过程中的免疫性炎症可导致眶内成纤维细胞增殖并产生大量的GAG，其主要成分为HA，后者吸水强,使眶内容物体积过度膨胀[30]。此外，HA的产生还与TAO成纤维细胞促甲状腺激素受体(TSHR)的表达存在一定关系，在细胞功能模型中发现，TSHR可能介导活化眼眶成纤维细胞中的GD-IgG，GD-IgG可通过IGF-IR促进眼眶成纤维细胞生成HA[10]。对TAO患者的眶内组织学研究表明[31]，GAG主要聚集在眼眶脂肪和眼外肌结缔组织成分中，这种聚集造成脂肪体积增大，而GAG在眼外肌结缔组织内的积聚，也导致了眼外肌肌体明显增粗。与此同时，GAG生成的增加和组织的水肿，增宽了眼眶结缔组织的间隔。以上因素加剧了眼球被动向前移位，进而形成突眼。由于自噬水平与炎症程度的密切相关性，因此，自噬对TAO中GAG聚集的影响可通过对炎症的控制来实现。由此可见，对TAO患者自噬活性的合理调节可降低眼眶炎症反应，从而减少GAG聚集，进而缓解TAO进程。

2其他发病机制研究

除了自噬对TAO的影响，有学者认为TAO是由甲状腺和眼眶都表达的共同抗原导致的位点特异性自身免疫性疾病，并且以细胞免疫为主[32]。T淋巴细胞浸润眼眶后，T细胞及其细胞因子可能通过激活B细胞，刺激自身抗体的产生，促进黏附分子的表达，产生炎性细胞因子等途径参与TAO的发病[2]。不仅如此，这个过程所分泌的细胞因子可刺激成纤维细胞合成和分泌GAG，导致眼球突出等眼眶症状[33]。同时，TAO也被认为是由于通过TSHR介导的病原性抗体的作用所致的疾病[34]，Wakelkamp等[35]研究发现，TSHR mRNA在TAO患者眶减压术的离体脂肪细胞中高表达，且与TAO患者的临床活动度成正比。在TAO的发生过程中，TSHR与其他因子和信号分子之间的相互作用导致眼眶自身免疫反应，眼眶成纤维细胞增殖，前脂肪细胞分化为脂肪细胞，自身抗体产生，细胞因子分泌和眼外肌浸润[10]。此外，有研究发现TAO患者心脏钙固蛋白基因上调，提示自身对钙固蛋白的免疫可能是TAO发病机制的触发因素[36]。还有学者发现，TAO患者血清免疫球蛋白(IgG)可结合并激活眼眶成纤维细胞(OFs)中的胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)，认为IGF-1R参与了TAO的发病机制；随后的研究还证明，IGF-1R也在免疫系统水平上发挥作用，并且在B细胞和T细胞以及单核细胞中都有表达；来自TAO患者的IGF-1RAbs可以诱发甲状腺细胞和眼眶成纤维细胞释放吸引T细胞的细胞因子[37]。

此外，遗传和环境因素也在TAO的发生和发展中发挥着作用。在一项评估TAO、Graves病和桥本甲状腺炎患者一、二级亲属眼部和眼睑表现的研究中，33%甲状腺功能正常的亲属存在上睑退缩等TAO表现[38〗。吸烟、应激、感染、放射性碘治疗、干扰素和白细胞介素治疗等均可对TAO的发生与发展产生作用[39]。其中，吸烟是TAO的独立致病因素，且发病风险与吸烟的数量呈正比，Kau等[40]研究发现，TAO的眼眶成纤维细胞对香烟烟雾提取物的刺激反应过度，造成氧化应激增加，纤维化相关基因表达，尤其是使结缔组织生长因子以及细胞内转化生长因子-β1和白细胞介素-1β水平升高。Cawood等[41]在体外TAO模型中证明，香烟提取物作用下，GAG的产生和脂肪生成以剂量依赖的方式增加。而与以往吸烟者相比，吸烟者的甲状腺眼病严重程度取决于目前吸烟者每天吸烟的数量[42]。

3总结与展望

综上所述，细胞自噬在TAO的发生发展中发挥着重要作用，适当降低自噬水平可减弱TAO患者眼眶炎症、减少脂肪形成和GAG聚集，从而缓解TAO的进程。目前对自噬的研究多集中在其对炎症和脂肪形成中的作用，对GAG聚集和成纤维细胞分泌的其他细胞外因子的影响报道尚少，如自噬对1型胶原蛋白分泌的影响等。自噬是一把双刃剑，适当水平的自噬可以帮助机体抵御外部压力，但自噬水平过高则会使病情恶化，对机体起损害作用。因此，对自噬活性的合理把握需要进一步研究。同时，纤维化也是TAO发病机制中的一部分，且自噬对纤维化作用报道也尚少。为此，我们期待对细胞自噬的深入研究可以为TAO提供新的诊疗思路。