ATP-TCA法指导膀胱癌术后个体化用药方案的临床应用

常贺翠

膀胱癌是我国人群泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，其发病率与病死率呈逐年增长趋势[1-3]。术后采用抗肿瘤药物膀胱灌注治疗可在一定程度上降低术后癌症的复发率，改善患者预后。然而灌注化疗方案的个体化选择较困难，容易出现耐药等情况[4-6]。因此，选用敏感的化疗药物进行个体化治疗是提高疗效的关键。

1 资料与方法

1.1 资料来源 选择2014年1月-2016年1月安徽医科大学第一附属医院收治的膀胱癌患者的肿瘤组织标本60例(新的肿瘤组织标本，取材前患者均未接受放化疗)，所有标本均经病理学检查确认为膀胱癌，根据治疗方法不同分为药敏组35例和对照组25例。药敏组男25例，女10例；年龄(58.4±1.6)岁；分期：pTa 22例，pT1 13例；病理分级：C15例，C218例，C312例。对照组男18例，女7例；年龄(50.9±2.1)岁；分期：pTa 8例，pT1 17例；病理分级：C16例，C25例，C314例。药敏组取材后即刻进行ATP-生物荧光法(ATP-TCA)检测[7]。药敏组化疗方案取决于药敏试验，对照组根据临床经验制定化疗方案，2组均随访2年。

1.2 药物与仪器 4种化疗药物分别为：表柔比星(EPI，浙江海正医药股份有限公司生产，10 mg/支)、吉西他滨(GEM，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，0.2 g/支)、丝裂霉素(MMC，浙江海正医药股份有限公司生产，2 mg/支)、吡柔比星(THP，浙江海正医药股份有限公司生产，10 mg/支)。仪器：细胞培养板，微孔板荧光分析仪(Berthord公司生产)，ATP-TCA试剂盒(浙江海创科技有限公司生产)包括完全培养基、ATP抽提剂、肿瘤组织消化酶、荧光素—荧光素酶、稀释缓冲液、ATP标准液，药物储存液(用0.9%氯化钠溶液或葡萄糖溶液配制)-20 ℃分装保存。

1.3 体外药敏试验 在无菌条件下，于30 min内用75%乙醇清洗新鲜的肿瘤组织标本，并将标本组织剪成约1 mm3的小块，将消化酶加入肿瘤组织，在37 ℃的培养箱中消化2 h，每隔20 min混合1次。将溶液倒入200目的筛网中过滤，离心5 min，弃上清液，将红细胞裂解液加入过滤后的溶液里，继续离心5 min，用CAM重悬制成细胞悬液。取细胞悬液台盼蓝染色，计数细胞数，并调细胞悬液使细胞浓度为(1～3)×105个/ml。药物试验浓度参考各药物常用临床剂量所对应的血浆峰值浓度(PPC)：THP 1 mg/ml、EPI 1 mg/ml、GEM 5 mg/ml、MMC 0.34 mg/ml。将化疗药物置于细胞培养板内，按倍比依次稀释至5个梯度药物浓度(200%～12.5%)，每个浓度2个复孔，同时设定M0为无药对照孔，MI为空白孔，只有200 μl完全培养基，作为检测背景值。分别在5% CO2，37 ℃培养箱中孵育3 d。培养结束后，将肿瘤细胞ATP抽提剂(30 μl)加入微孔板内，混匀，加入荧光素酶工作液40 μl到各个检测孔，1 min后置入荧光检测仪中逐列进行检测。

1.4 数据处理 采用微孔板荧光分析仪计算各药物浓度梯度的细胞抑制率、抑制50%肿瘤细胞生长的药物浓度(IC50)和抑制90%肿瘤细胞生长的药物浓度(IC90)。将药物对肿瘤的影响分为：敏感：IC50≤25%PPC；轻度敏感：IC90≤100%PPC且IC50>25%PPC，或Index≤300；耐药：IC90>100%PPC且IC50>25%PPC且Index>300。敏感率=敏感例数/(敏感例数+耐药例数)×100%。

2 结 果

2.1 膀胱癌标本的可评价率 药敏组35例膀胱癌标本均成功进行了4种药物的敏感性测定，可评价率为100.0%(35/35)。

2.2 药敏组患者化疗药物的敏感性和耐药性 4种化疗药物中，单种药物的敏感率为THP>MMC>GEM>EPI。THP的敏感率明显高于GEM、EPI(P<0.01)，MMC的敏感率高于GEM和EPI(P<0.05)。见表1。

表1 药敏组35例膀胱癌细胞对化疗药物体外敏感性

2.3 远期疗效 2年的医学随访期内，药敏组患者肿瘤复发率低于对照组，2年生存率高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 2组患者远期疗效比较 [例(%)]

3 讨 论

膀胱灌注在预防膀胱癌复发方面起着重要作用[8-9]。但由于肿瘤异质性(形态异质性、基因异质性和功能异质性)，导致肿瘤细胞对药物的敏感性存在个体差异[10]，治疗过程中普遍发生肿瘤多药耐药，原发或继发性耐药导致部分患者化疗失败，局部复发和远处转移[11-12]，严重影响肿瘤化疗成效[13]。

个体化治疗是肿瘤化疗成功的关键，肿瘤的药敏试验在个体化化疗中具有重要意义。近年来，各种体外化疗药物敏感试验为临床治疗肿瘤提供了越来越多的依据，使个体化治疗的成功率大大提高，其中ATP-TCA法具有敏感、迅速、疗效高的特点。研究显示，ATP-TCA法在指导个体化治疗的肺癌患者中取得了良好的临床应用价值，但ATP-TCA法在乳腺癌、消化道肿瘤及膀胱癌个体化用药中的应用较少，数据不够，此法尚处于初步阶段[14]，还需进行进一步的研究。

本研究结果显示，药敏组标本的可评估率为100.0%，药敏组35例标本中，敏感率较高的化疗药物依次为THP(77.1%)>MMC(62.9%)>GEM(25.7%)>EPI(8.6%)，与GEM、EPI比较，THP和MCC敏感率明显增加。因此，临床应用化疗药物时要慎重使用GEM和EPI，THP和MMC可在一线化疗方案中考虑使用。此外，对2组患者随访2年，结果显示，药敏组膀胱癌2年复发率为14.3%，明显低于对照组的36.0%，且药敏组患者2年生存率85.7%，高于对照组的64.0%，提示基于ATP-TCA法个体化化疗对提高膀胱癌患者远期疗效具有一定指导意义。

由于本研究涉及的样本量有限，研究周期较短，纳入的药物种类少，导致研究结果可能存在偏倚。因此，下一步研究拟扩大样本量，并增加其他常用化疗药物，特别是小分子靶向药物，增加患者随访研究时间，以期为提高患者化疗疗效、减少耐药性、减轻化疗不良反应对机体的影响、减轻患者经济负担、降低膀胱癌术后复发率，进一步提高膀胱癌患者的生活质量及生存率提供临床依据。