外源钙对水曲柳生长、光合特性及水分利用效率的影响

任城帅，李 慧，翁小航，张淞著，刘丽颖，周永斌，

（1.沈阳农业大学 林学院，沈阳110161; 2.辽宁辽河平原森林生态系统定位研究站，辽宁 昌图112500）

钙是植物生长发育的必需营养元素之一，植物的成花诱导、花芽分化及开花调控等过程都与钙离子（Ca2+）密切相关，Ca2+还有助于增强植物茎杆的硬度和植株挺立。 近年来，随着植物钙调素的发现与研究深入，钙与园林植物的生理关系也逐渐引起人们的关注[1]。 钙含量过高或过低均会影响相关生理生化过程，最终导致植物受到伤害。不同植物对钙有不同的需求，这就产生了植物对钙适应的不同机制[2]。有研究结果表明，外源钙处理可以改善植物在逆境胁迫条件下的生长状况，从而提高植物的抗逆性[3]。 蒲玉瑾等[4]研究发现，施加外源Ca2+可以缓解低温对降香黄檀光合作用和水分利用效率的抑制，随着Ca2+浓度升高其各项指标呈先升后降的趋势。另有研究表明，增施适宜浓度的钙肥有利于番茄光合性能的提高，外源钙可以提高葡萄（Vitis vinifera）和甜椒（Capsicum frutescens）在高温胁迫下的净光合速率（Pn）和光系统II （PSII）最大光化学效率[5-6]。 农作物上已有钙对其生长发育的影响方面的相关报道， 但目前尚未有关于钙对水曲柳影响的研究报道。 本试验从钙对水曲柳生物量、生长量、光合参数、叶绿素荧光、水分利用效率和植物叶片钙含量方面进行研究，以期为进一步深入研究钙对水曲柳生长发育特性和科学施肥提供理论依据，进以提高水曲柳在园林绿化中的应用品质。

1 材料与方法

1.1 水曲柳幼苗的培育及处理

试验于2018 年4～8 月在沈阳农业大学后山实验基地进行。 选用1 年生大小一致的水曲柳树苗，2018 年4月开始进行水培，待幼苗生长一段时间并生根后对其进行钙处理，5～7 月每周更换1 次营养液。

营养液pH 值为5～6。试验设定5 个Ca2+浓度水平：0，100，200，400，800mg·kg-1。钙由无水CaCl2提供，其他提供大量元素的化合物为KCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4、EATA-Na2和FeSO4·7H2O。

1.2 测量方法及指标

1.2.1 生物量的测定 水培试验后将水曲柳幼苗取回，分为叶、侧枝、新干、老干、根5 部分。清水洗净擦干装于信封后，置于105℃烘箱杀青0.5h，之后调制烘箱温度为80℃烘干至恒重。 使用千分之一天平分别称量其干重。

1.2.2 生长量的测定 在对水曲柳幼苗进行钙处理前，使用直尺测量各组树苗的株高，用游标卡尺测量其两点基径并取平均值以记录。 钙处理后，于收苗前再次测量树苗株高与基径，并根据各处理中水曲柳树苗的平均株高生长量以及平均基径生长量。

1.2.3 光合参数的测定 在水曲柳幼苗生长最优时期（2018 年6 月），选择晴朗天气条件下的每日上午8∶30～11∶30，使用Li-6400 便携式光合测定系统（LI-COR，Inc，USA）测定水曲柳叶片的净光合速率（Pn），气孔导度（Cond）和蒸腾速率（Tr）等光合参数。 有效光辐射强度（PAR）控制在1000μmol·m-2·s-1，重复3 次进行测量。

1.2.4 叶绿素荧光参数的测定 在晴朗天气的上午9∶00～11∶00，对水曲柳叶片进行20min 暗处理后，使用便携式脉冲调制荧光仪测量不同钙浓度处理下水曲柳幼苗的最大光化学效率（Fv/Fm）和潜在光化学效率（Fv/F0）。

1.2.5 水分利用效率 在施钙处理至产生生长差异性后开始破坏性采样， 将水曲柳叶片洗净后放入105℃烘箱内杀青30min，然后80℃烘干至恒质量，研磨后过100 目筛制成备用样品。使用稳定同位素质谱仪（DELTAV Advantage Isotope Ratio Mass Spectrometer）检测CO2的13C 与12C 的比率，与国际标准物（pee dee belemnite，PDB）比对，计算出样品13C/12C 与标准物13C/12C 偏离的千分率，即为样品的δ13C 值，根据以下公式进行计算：

式中：A 为净光合速率；gs为气孔导度；ca和ci为大气和叶片细胞内的CO2气压值；a,b 分别为CO2扩散到气孔时产生的分部效应和气孔光合羧化酶RUBP 对碳同位素的分部效应。

1.2.6 植物钙测定 将幼苗叶片置于105℃烘箱中杀青0.5h，60℃烘干至衡重。使用粉碎机将叶片粉碎，再将叶片样品使用球磨仪粉碎，过100 目筛，使用湿灰化法测定植物叶片钙浓度。 精准取样0.1g，置于锥形瓶中，加入硝酸、高氯酸混合酸（硝酸∶高氯酸=4∶1）10mL，将漏斗放置锥形瓶口上，置于加热板上，控制加热板温度逐渐升高，使样品消化至无色透明后移入50mL 容量瓶并加入屏蔽剂（氯化锶30g·L-1），之后使用原子吸收分光光度计测定样品钙含量。

1.2.7 数据处理 利用Excel 和SPSS 软件对试验数据进行统计分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 外源钙对水曲柳生物量及生长量的影响

由表1 可知，水曲柳的叶、侧枝、新干、老干、根生物量以及总生物量在施加外源Ca2+处理后与未施钙处理的对照相比提升显著（p＜0.05），且随着Ca2+浓度升高其数值呈先升后降的趋势，均在200mg·kg-1时达到最大，说明200mg·kg-1处理对水曲柳生长的促进效果最为明显，分别达到其最优值2.058，0.489，0.435，1.885，3.308，7.722g。 由此可见，外源Ca2+的施加确实使得水曲柳生长量有所提升，而且存在最适处理的Ca2+浓度，使水曲柳的各部生长指标达到峰值。 结果表明，对水曲柳试验幼苗施加浓度为200mg·kg-1的外源Ca2+，植株的各部生物量和总生物量与其他处理相比均出现显著差异 （p＜0.05）， 但随着Ca2+浓度的持续升高， 在400mg·kg-1和800mg·kg-1浓度下水曲柳各部生物量及总生物量较200mg·kg-1处理时出现下降， 说明一定浓度的钙可以促进水曲柳的生长。

表1 钙对水曲柳幼苗叶、侧枝、新干、老干、根和总生物量的影响Table 1 Effect of calcium on leaves, side branches, new stems, old stems, roots and total biomass of F.mandshurica seedlings

由图1 和图2 可知，随着Ca2+浓度的升高，水曲柳的株高与基茎增量均呈现先升后降的趋势。 在不同Ca2+浓度处理水平下，试验幼苗的株高与基茎较对照相比出现不同程度的升高，且在Ca2+浓度为200mg·kg-1时分别达到其最大值（株高平均增长量为8.175cm,基径平均增长量为1.785mm）。与其他浓度处理间产生显著差异（p＜0.05）。这说明施加外源Ca2+浓度为200mg·kg-1时，水曲柳生长量增幅最高，随着Ca2+浓度的逐渐升高，在处理水平高于400mg·kg-1后，外源Ca2+对水曲柳生长的促进效果下降明显，这与其生物量的变化趋势吻合，从而再次证明200mg·kg-1Ca2+的浓度对水曲柳的生长发育产生最有利。

2.2 外源钙对水曲柳幼苗光合特征的影响

由图2～图5 可知，施加外源Ca2+会对水曲柳的光合起到促进作用，试验中植株的光合指标（净光合速率Pn、气孔导度Gs、蒸腾速率Tr）随着营养液中Ca2+处理水平的提高呈现先升高后降低的趋势。 Ca2+水平在0～200mg·kg-1时，水曲柳的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率均大幅提高，较未施加钙处理的对照差异显著（p＜0.05）。同样，当Ca2+浓度为200mg·kg-1时，其光合指标分别达到最优值（净光合速率的最优值达到7.972μmol·m-2·s-1，气孔导度最优值达0.086mmol·m-2·s-1，蒸腾速率最优值达到1.792mmol·m-2）。 而根据试验设定，随着营养液中Ca2+浓度的继续升高，水曲柳光合指标下降趋势明显。由此说明，200mg·kg-1的Ca2+浓度对试验植株的各项光合指标产生最适影响，过高浓度的Ca2+会抑制水曲柳的光合。

2.3 外源钙对水曲柳幼苗叶片光合系统Ⅱ的影响

由图6 和图7 可知， 水曲柳幼苗的PSⅡ的潜在光化学效率（Fv/Fo）和最大光化学效率（Fv/Fm）均在Ca2+为200mg·kg-1时达到峰值，（Fv/Fo最优值为4.555，Fv/Fm最优值为0.818）。 随着外源Ca2+的加入，水曲柳的叶绿素荧光参数增幅明显，较未施钙前的处理提升显著（p＜0.05）。 由于Ca2+浓度的升高，水曲柳叶绿素荧光参数与其光合指标变化一致，即两类指标均呈先升后降的趋势，并且，在未施钙和Ca2+浓度超过400mg·kg-1时水曲柳最大光化学效率（Fv/Fm）均小于0.8，产生胁迫。 从而在另一方向证明水曲柳在施加外源Ca2+处理为200mg·kg-1时达到最适水平。

图1 水曲柳株高增量Figure 1 Increase in plant height of F.mandshurica

图2 水曲柳基茎增量Figure 2 Increase in basal stem of F.mandshurica

图3 水曲柳净光合速率Figure 3 Net photosynthetic rate of F.mandshurica

图4 水曲柳气孔导度Figure 4 Stomatal conductance of F.mandshurica

图5 水曲柳蒸腾速率Figure 5 Transpiration rate of F.mandshurica

2.4 外源钙对水曲柳幼苗水分利用效率的影响

由图8 可知，施加外源Ca2+后水曲柳的水分利用效率较未施钙处理产生显著提高（p＜0.05）。 随着Ca2+浓度的提高，其水分利用效率呈上升趋势。 在Ca2+浓度达到800mg·kg-1时，试验植株水分利用效率达到118.824g·kg-1，相比较其未添加钙处理时增加15.267%。 从低钙处理（100mg·kg-1）到高钙处理（800mg·kg-1），水曲柳水分利用效率的持续提升体现了外源Ca2+对其水分利用效率明显的促进作用。

图6 水曲柳潜在光化学效率Figure 6 Potential photochemical efficiency of F.mandshurica

图7 水曲柳潜在光化学效率Figure 7 Potential photochemical efficiency of F.mandshurica

2.5 水曲柳钙累积

由图9 可知，随着Ca2+处理浓度的升高，水曲柳试验幼苗中的钙含量大幅上升，各处理水平下水曲柳钙积累量的差异均达到显著差异（p＜0.05）。 当营养液中Ca2+浓度分别为100，200，400，800mg·kg-1时，水曲柳中钙含量分别达到14110，19010，28415，37775μg·g-1， 较未添加钙处理时水曲柳钙含量分别增加184.19%，248.16%，370.93%，493.11%。 在处理水平为800mg·kg-1时呈现最大值。

图8 水曲柳水分利用效率Figure 8 Water use efficiency of F.mandshurica

图9 水曲柳钙积累Figure 9 Calcium accumulation in F.mandshurica

3 讨论与结论

添加适量的钙可以改善光合代谢，使植物叶片保持较高的光合性能。 光合作用是植物生长发育和产量形成的基础[7]，为植物有机物合成与能量获取的途径之一，其参数可揭示植株生长与抗逆性强弱的程度[8]。 本研究结果表明，不施钙条件下和高钙处理的水曲柳叶片光合速率、气孔导度、蒸腾速率均较低。 在施钙浓度达到200mg·kg-1时，其光合特性达到最优。导致此现象的原因是钙作为信号物质参与植物的光合作用电子传递和光合磷酸化等生理生化过程，对植物的光合作用有着重要的作用[9]。 并且施用钙可以缓解其净光合速率的衰减，并提高各时期叶片内叶绿素含量[10]，从而改变水曲柳的光合特性。但是，过高的钙含量也可能导致钙毒性。植物细胞内过量的钙可以与磷酸盐一起形成沉淀，会干扰光合作用，降低植物生长速率[11]。

叶绿素荧光的参数变化可反映出不良环境对植物光合性能的影响。 与表观的光合指标相比，叶绿素荧光参数更能反映植物光合系统的内在特性[12]，其中PSII 的最大光化学效率Fv/Fm是光抑制的敏感指标，反映植物的潜在最大光合能力，水曲柳光抑制程度越高则叶片PSⅡ的Fv/Fm越低。Fv/Fo是PSII 反应中心的潜在活性[13]，试验结果显示，随着钙离子的加入，水曲柳的叶绿素荧光的参数Fv/Fm与Fv/Fo均发生显著提高，在钙浓度为200mg·kg-1时最优。 这说明适量钙的施加提高了水曲柳叶片PSII 的电子传递速率，提高了水曲柳的PSII 剩余活性中心的效率[14-15]。一旦施加钙的浓度超过最适钙浓度，则会降低水曲柳的潜在最大光合能力与PSII 反应中心的潜在活性。 由于植物叶绿素荧光参数在各种胁迫下表现的十分敏感，它们可以作为鉴定植物抗逆性的理想指标[16]。 本试验结果表明，施钙可以提高水曲柳的光合性能，高浓度的钙则会对水曲柳的生长产生胁迫反应。

植物水分利用效率是蓝色革命更加具体的思想和举措，是农林业未来发展的关键方向和潜力所在[17]。 叶片水分利用效率作为植物生理活动过程中消耗水分形成有机物质的基本效率， 成为确定植物体生长发育所需要的最佳水分供应的重要指标之一[18-19]。 由于水分利用效率可用于估算环境因素对植物的影响。 因此，叶片的水分利用效率可以作为一种简单方法用于评价限制植物生长因素[20-21]，可为探寻水曲柳最适钙浓度提供理论支持。 而钙作为一种重要的矿质元素，植物细胞具有一系列感知内源和外源信号或刺激的精巧机制[22]。 钙累积量是生物量与钙含量的乘积，钙累积量变化动态是树体钙素吸收动态的体现[23]，植物主要通过木质部将根系吸收的钙转运到新叶等部位[24]。在本研究中，出现了水曲柳植物钙累积的被动吸收，随着营养液钙浓度提升，水曲柳钙累积含量大幅度升高，水曲柳的生物量与生长量确实在施钙处理的影响下发生显著提升。 同时发现，水曲柳水分利用效率会因为施钙而提升，随着了解到外源钙对于水曲柳水分利用效率的促进作用，也为提高植物水分利用效率，从而缓解植物的干旱胁迫的研究提供思路。 由此可见，适宜的钙可以作为一种外源调节物质增强水曲柳抗逆能力,随着钙浓度的提升，依靠增强根系吸收钙能力提高钙在水曲柳中的累积量，以及调节植物的生长发育[25-26]。

适宜的钙浓度可以促进水曲柳的生长,浓度过低或过高的钙离子对水曲柳的生长产生抑制作用。 施钙能够有效提升水曲柳的光合特性，其净光合速率、气孔导度、蒸腾速率等光合指标均取得显著改善。水曲柳的叶绿素荧光参数同样随着钙的施加产生明显变化，存在最适宜的钙浓度使得水曲柳的叶绿素荧光参数出现最优值。水曲柳叶片钙含量随着钙浓度增加持续累积，钙对水曲柳水分利用效率具有明显促进作用，钙可以提高水分利用效率，缓解植物干旱胁迫。

综上，最适合水曲柳生长的钙浓度为200mg·kg-1。 当钙的施加达到最适值时，水曲柳的生物量、净光合速率、气孔导度、蒸腾速率以及PSⅡ最大光化学效率等数值均随之达到最优值，钙浓度高于或低于其最适浓度时都会对水曲柳的生长产生抑制作用，使其未能得到最优生长效果。