阿魏酸酯酶功能特性及应用概述

温承坤，李琴，蔡开云，陈萍，郭婷婷，陈茂彬*

1(湖北工业大学 生物工程与食品学院，湖北 武汉，430068)2(湖北省酿造工艺与装备工程技术中心，湖北 武汉，430068)3(湖北稻花香酒业股份有限公司，湖北 宜昌，443000)

21世纪是科学创新的时代，如何利用科学创新实现可持续发展的理念，成为人们思考的问题。木质纤维素被广泛应用于生产燃料乙醇、制浆造纸、动物添加饲料及制药工业用的生物活性酚等方面，随之而来的是生产原料逐步减少的问题，因此利用生物方法高效利用可再生木质纤维素，将其转化为低分子质量的碳源，成为当前关键要点[1]。由于植物细胞壁呈交联网络结构，需要一系列纤维素酶和半纤维素酶的协同作用来降解。因此，阿魏酸酯酶在水解羧酸的过程中具有重要的作用，由于植物细胞壁内的羟基肉桂酸和糖之间存在不易降解的酯键，因此需要阿魏酸酯酶的作用来切断相连的酯键，促进其他酶类物质和植物细胞壁结合，最后作用于木质纤维素，达到释放羧酸的目的[2]。此外，研究表明，阿魏酸酯酶还具有许多其他生物技术功能，如生产燃料乙醇、制浆造纸、添加动物饲料、合成保健和制药工业用的生物活性酚组分等。

1 阿魏酸酯酶简介

阿魏酸(ferulic acid，FA)是一种广泛分布于果蔬表皮或根部，谷物麸皮等部位的酚酸[3]。天然阿魏酸主要与糖、脂类、多胺和蛋白质多糖结合存在[4]。阿魏酸作为一种功能物质，具有多种生理功能，如抑菌消炎等作用。吸收的阿魏酸在肝脏中代谢，其中大部分(60%～90%)转化为共轭形式(阿魏酸硫葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酸苷)，并在尿液中排出[5-7]；同时，阿魏酸是一种天然抗氧化活性成分，能去除机体内的自由基，达到延缓衰老的作用[8]；阿魏酸通过抑制肝脏中胆固醇合成，来预防冠心病[9]；与此同时，阿魏酸具有低毒性，经监测分析，雄鼠LD50=2 445 mg/kg；雌鼠LD50=2 113 mg/kg，因此可作为保鲜剂、抗氧化剂应用于食品中，日本现已将其列为食品添加剂添加至食品中起抗氧化作用[10]。

木质纤维素是一种可再生材料，无毒害，且无放射性，已被普遍应用。但如何利用生物新技术进行有效利用可再生木质纤维素成为研究热点。而关键技术在于破解植物细胞壁内部的交联网状结构。因此，需要阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase，FAE)来打破如何破解网状结构的障碍，阿魏酸酯酶是一种羧酸水解酶，可以破坏这种结构，加快纤维素的降解[11]，帮助释放多种抗氧化物质，并在食品、生产生物乙醇、化妆品、医药、造纸等领域广泛使用[11-12]。文章围绕着阿魏酸酯酶的来源、获取、作用、分子结构、生产应用及发展潜力方面，对阿魏酸酯酶进行综述。

2 阿魏酸酯酶来源

在阿魏酸酯酶的相关研究中，自初次发现阿魏酸酯酶[13]以来，随着对阿魏酸酯酶研究的深入，发现阿魏酸酯酶被认为是许多微生物半纤维分解酶系统的常见成分。并陆续发现在植物、动物、微生物中均能产生阿魏酸酯酶。由此可见，自然界中FAE的来源分布较为广泛，于是可根据不同来源，将其划分为微生物阿魏酸酯酶和植物阿魏酸酯酶两种。

2.1 植物阿魏酸酯酶

现有研究发现，在麦芽等发芽谷物中均检测到阿魏酸酯酶的活性，但是相关报道极少，与此同时,关于阿魏酸酯酶在植物体内存在的具体功能也非常少。刘莎莎等[14]对大麦粒和麦芽中阿魏酸酯酶活性进行检测，首次发现阿魏酸酯酶的活性，且阿魏酸酯酶活性在大麦培养温度为25 ℃，发芽2 d后处于最高，于是推断出这种酶可能对大麦的发芽过程产生影响。LATHA等[15]从发芽的龙爪稷中，经过分离纯化也得到了一个分子质量为79.4 kDa的阿魏酸酯酶，含4个亚基。

2.2 微生物阿魏酸酯酶

1991年媒体报道首次得到纯化的阿魏酸酯酶[16]。伴随着科学技术迭代跟新，阿魏酸酯酶的研究方法不断更替，故30多个阿魏酸酯酶被纯化并从几种微生物中进行表征，如嗜酸乳杆菌、索氏青霉菌、嗜皮诺青霉菌等，纯化后的阿魏酸酯酶在分子质量、等电点和最佳水解反应条件等物理特性方面表现出显著的变化。分子质量为11～210 kDa，等电点为3～9.9。阿魏酸酯酶的物理化学特性与其最佳反应条件之间没有相关性。微生物阿魏酸酯酶具有广泛的pH值和温度依赖性，最佳活性出现在pH值4～8和30～65.8 ℃。综合众多研究结果，发现阿魏酸酯酶能通过丝状真菌和细菌的胞外分泌获取，值得注意的是，曲霉属的丝状真菌在能够产阿魏酸酯酶的微生物中占1/3。

2.2.1 真菌阿魏酸酯酶

真菌的培养基质是影响真菌产阿魏酸酯酶的主要因素。自然界中，由于大部分真菌生长于一些枯枝和草木的茎干上，故当培养基质中存在着木质纤维素类物质时，阿魏酸酯酶才能够被诱导产生，这也是因为阿魏酸酯酶作为一种诱导酶，存在着特殊的诱导机制所决定的。因此，一旦培养基质发生改变，部分真菌则无法诱导产生阿魏酸酯酶，与此同时，不同种类的真菌所需要的培养基质也不相同[17]。在现有的研究中，已经分离纯化出6种阿魏酸酯酶，它们分别是FAE-Ⅰ，FAE-Ⅱ，AnFaeA，AnFaeB，FAE-1和FAE-2，且这6种酯酶的理化性质和作用基质均不相同，其中碱性阿魏酸酯酶为FAE-1和FAE-2[18]。由此可知，不同来源的阿魏酸酯酶最适反应温度、pH等相关性质各不相同。其中，Neocallimastix MC为现有研究中能够产生最小分子质量阿魏酸酯酶的真菌，所产分子质量为11 kDa[19]。尽管同一株真菌能分离出具有相同最适反应温度、最适反应pH等理化性质的阿魏酸酯酶，但在底物特异性方面存在着较大差异，同时它们对木质纤维素的降解作用具有一定的差异性。

2.2.2 细菌阿魏酸酯酶

据相关研究报道，在动物及人类的肠道细菌中发现存在阿魏酸酯酶，此外还有一部分阿魏酸脂酶来源于植物致病菌和瘤胃细菌。这一类阿魏酸酯酶能够帮助吸收从膳食纤维中释放出来的游离阿魏酸，实现乳酸菌的抗氧化性作用。COUTEAU等[20]在人体排泄物中分离出35种细菌，并对它们进行阿魏酸酯酶活性检测，发现有6种细菌具有阿魏酸酯酶活性，并且证实了肠道中细菌能够将膳食纤维中游离阿魏酸释放出来，且有助于人体健康。ABEIJN MUKDSI等[21]对小鼠进行投喂实验，发现摄入奶酪的小鼠抗氧化性明显高于对照组小鼠，其中血浆中硫代巴比妥酸降低2倍，谷胱甘肽还原酶升高5倍，因此说明了乳酸菌产生的阿魏酸酯酶能帮助阿魏酸等抗氧化物质在肠道中得到充分利用。LI等[22]克隆出FAEⅠ、FAEⅡ和FAEⅢ三种阿魏酸酯酶，并且对这3种阿魏酸酯酶的理化性质进行分析，发现3种酶最适作用温度在40 ℃，最佳pH分别为6.0～7.0、8.0和9.0，通过分析，猜测出Fae Ⅰ和而Fae Ⅱ两种阿魏酸酯酶在木质纤维素降解中的协同作用机制：首先前者松开天然纤维素结构，将纤维素暴露出来，然后被降解成小分子酚酸-糖酯；后者酶与小分子底物有很高的亲和力，能够快速降解进入细胞的底物。

3 阿魏酸酯酶的生产

在利用微生物发酵生产阿魏酸酯酶的过程中，固态发酵法和液体发酵法是目前最主要的两种发酵方法，其中固态发酵[23]原料主要采用工农业副、废产品，如麸皮、薯粉、玉米粉和高粱等一类具有经济易得、富含营养物质作用的物质。所以固态发酵法具有发酵周期短、能耗少、耗水量低，对环境污染程度低等诸多优势，相比于复杂的液态发酵过程，固态发酵是目前生产阿魏酸酯酶的主要选择。因为小麦麸皮细胞壁中的物质在阿拉伯糖和阿魏酸等桥链作用下，细胞壁形成不易被降解的网状结构。如果要实现阿魏酸的高效释放，则需要阿魏酸酯酶、纤维素酶和木聚糖酶3种酶共同作用，通过破坏结构紧密的网状结构，达到降低纤维素间的阻碍作用。

当生产阿魏酸酯酶采用固态发酵法时，要求发酵基质中存在淀粉基和纤维素基，如玉米麸和燕麦木聚糖等。所以将发酵底物基质的理化性质[24]作为影响微生物发酵生产阿魏酸的主要因子。为了比对不同因素对阿魏酸释放的影响程度，SAMAD等[25]利用枯草芽孢杆菌作为发酵菌株，添加至香蕉茎秆废物中进行发酵实验，并采用共培养的方法进行发酵实验，最终实验结果显示，pH值、料液比、共培养类型，接种量，搅拌5种因素对阿魏酸的产量具有比较明显的影响，其中pH值因素的影响最大，料液比因素影响最小。SAMAD等[25]使用脱淀粉麦麸和麦麸作为两种不同的发酵底物。结果表明，麦麸酶产量最高，是去淀粉麦麸的2倍，故可认为诱导FAE产生的主要因素为阿魏酸酯键。

4 分子结构解析

FAE作用的底物结构相对复杂，大部分阿魏酸酯酶整体呈现为结构紧凑的球蛋白，并由多个α螺旋包围多个连续的β折叠片，从而形成典型α/β水解酶结构[26]。与此同时，在活性中心均存在由“丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸(Ser-His-Asp)”构成的典型催化三联体结构，但对于来自不同类型的FAE，它们之间的空间结构也各不相同。例如，A类阿魏酸酯酶来源于黑曲霉，5个α螺旋和2个β折叠片将在FAE-Ⅲ中心存在的9个相连β折叠片包围起来[27](图1)。

图1 阿魏酸酯酶 A(FAE-Ⅲ)的拓扑空间结构

SAMAD等[25]研究发现，A、B、C、D这4种不一样的阿魏酸酯酶，它们之间保守序列和基因序列各不相同，由此可证实酯酶基因序列所在的保守序列可能与其底物的异同性存在关联。在A型阿魏酸酯酶典型的GHSLG形式的保守序列中，Ser、Asp、His共同构成了阿魏酸酯酶的三联体催化活性中心，即Ser133-Asp194-His246[28]。另外，在FAE-Ⅲ的活性位点，存在一个环状残基和一个盖状区域，其中，环状残基的调整性可以促进底物结合，盖状区域决定底物的特异性，而在FAE序列中，特殊的N-糖基化位点使活性位点保持开放型构象的状态。当催化反应开始时，阿魏酸酯酶的催化中心和辅助中心共同束缚底物中的阿魏酸残基，并经过一系类化学反应使酯键断裂，游离出阿魏酸。

5 阿魏酸酯酶的应用现状

5.1 合成酚酸类化合物

由于这一类酚酸物质具有抑菌、抗肿瘤、防紫外线、抗氧化等作用，所以FAE广泛应用于多种行业中。然而，由于这些酚酸分子含有双键，且烷烃相对较短，增加了亲水性，削弱了脂肪的溶解性，从而影响其在人体的运输和利用，所以在很大程度上应用于油性食品和化妆品。研究发现，FA以酯键的形式与糖、醇或脂质基质结合，可显著提高阿魏酸的脂溶性，增加其稳定性。

5.2 生物加工

阿魏酸酯酶作为完成木质纤维素水解必需辅助酶，被有效应用于生成生物乙醇等产品。将阿魏酸酯酶与其他水解酶和氧化酶联合使用，能够显著促进植物材料的分解，提高可发酵碳水化合物的利用率并释放出酚类和有毒的酯类化合物，从而抑制预处理木质纤维素材料的发酵过程[29]。基于此，部分研究者尝试通过构建基于阿魏酸酯酶与其他酶类的融合蛋白，来提高催化效率或底物亲和力[30-31]。工业生产过程中使用的酶除了要求有高的催化活性，还必须能耐受极端条件，如高温。许多课题组为了改善阿魏酸酯酶的耐热性，采用了不同的策略构建了多种阿魏酸酯酶突变体，使其可以耐受生物过程中的高温[32-33]。

5.3 食品及医药领域

阿魏酸和其他羟基肉桂酸是酚类植物性化学物质，其独特和有效的特性可作为抗氧化剂[34]、防晒因子[35]、脱色素剂等[36]被广泛用于食品及化妆品行业。阿魏酸等羟基肉桂酸可作为VC和VE的载体，使皮肤光防护增强，同时由于亲脂性更强，从而能更好地渗透到角质层[37]。同时，它们还具有抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗血栓等多种药效及保健功能[38]。

FAE-A可以有效增加小鼠血清中IFN-y、IL-4和IgG的含量，证实FA具有促进小鼠免疫功能的作用[39]。使用低聚糖阿魏酸酯可升高大鼠血清胰岛素水平，并降低血糖值，且不受大鼠是否怀孕的影响[40]。但部分研究表明，在血糖代谢方面，玉米皮低聚糖阿魏酸酯只对STZ诱导的糖尿病大鼠表现出降低血糖的作用，对健康大鼠无明显降血糖的效果。在肠道微生态方面，玉米皮低聚糖阿魏酸酯能够调节糖尿病相关菌群丰度，有效增加肠道菌群丰度及多样性，同时还能明显提升大鼠肠道中短脂肪酸的含量[41]。

5.4 制浆造纸工业

在制浆造纸工业中，为了生产出高品质纸张，工厂往往在传统的制浆造纸过程中，使用氯化物来去除易使纸浆呈黑色的木质素来获得高质量的纸浆，但去除的过程中产生含有大量芳香族有毒污染物的废水，并对环境造成严重污染，违背可持续发展观念。因此，企业生产寻求氯化物替代品，以期达到环保的目的。经研究发现，阿魏酸酯酶能够水解植物细胞壁间连接的木质素和碳水化合物的阿魏酸酯键，故阿魏酸酯酶作为一种去除木质素替代物被广泛应用于各类企业中。

5.5 饲料工业

在饲料工业中，纤维消化率是决定动物饲料品质的重要标准。低纤维消化率易导致动物消化不良，进而阻碍生物生长，诱发免疫应激反应，降低饲料转化率，最终降低养殖收益率。经研究发现，阿魏酸和羟基肉桂酸对动物自身健康有益[42],但植物细胞壁成分的阿魏酸化是反刍动物消化系统的主要抑制因素之一。在饲料中添加阿魏酸酯酶可以加速植物细胞壁成分的降解，提高植物营养素的纤维消化，同时还能提高动物对饲料的消化率，促进动物生长发育[43]。

6 结论

本文综述了现阶段阿魏酸酯酶相关研究，利用阿魏酸酯酶研发人畜食品、医药、造纸、生物燃料与饲料等产品成为当下热点，由于当前所获得的阿魏酸酯酶存在不稳定性的问题，因此需要研究者利用现代先进技术，如检测分析技术，对阿魏酸酯酶的活性进行测定和定量等，同时通过对阿魏酸酯酶进行深入研究，发现获取更多产阿魏酸酯酶菌株，并结合现代生物科学技术使其在植物、细菌等不同体系中进行高效稳定表达，最终提高阿魏酸酯酶在各类领域的应用价值。同样利用现代生物科学技术，开发出阿魏酸酯酶更多不同的功能，进而拓宽阿魏酸酯酶在生产生活的利用范围。除此之外，根据当前众多研究分析发现，FAE中最保守的就是Ser-Asp-His三点催化活性中心，且催化能力与His、Ser的构型密切相关，于是在接下来关于阿魏酸酯酶的研究中，研究者应该着重于如何利用阿魏酸酯酶三点催化活性中心的结构特性，来提高阿魏酸酯酶的活性和稳定性，这将成为研究者接下来的重点关注及研究方向之一。