响应面法分析烟草花药胚状体诱导的最佳条件

黄子彧，刘昭伟，周 毅，刘 胜，罗 亮，胡博尊，罗 柱，戴林建

（1.株洲烟草公司茶陵分公司，湖南 茶陵 412400；2.湖南农业大学，湖南 长沙 410128）

自1967 年，Bourgin 和Nitsch 成功利用烟草花药得到单倍体植株以来，国内外开展了许多对烟草花药培养的研究工作，不断优化培养过程[1-2]。花药培养的诱导频率受多个因素的影响，如基因型、培养条件、花粉发育时期、培养基等[3-6]。陈春艳等[7]认为4℃低温预处理48 h 能显著提高花药胚状体的诱导率。贾永炯[8]的研究发现在含0.4～0.8 mg/L 2,4-D 的Nitsch培养基上胚状体发生频率有所提高。李春玲等[9]与王立浩等[10]考察了不同碳源及其浓度对花药胚状体诱导的影响，结果发现，3%的蔗糖对花药的诱导率最高。刘仁祥等[11]对活性炭、大量元素与微量元素之间的关系做了研究，发现活性炭能平衡大量元素和微量元素之间的关系，从而促进胚状体的形成。

响应面法（Response surface methodology，RSM）是一种优化反应条件的有效方法，RSM 是数学方法和统计方法结合的产物，用于对受多个变量影响的问题进行建模和分析，其最终目的是优化响应值。RSM 最先应用于化学工业领域，后来随着研究的深入和扩展，逐渐应用于生物学、医学以及食品学领域[12-14]。响应面法能系统地优化反应条件，分析各因素间的互作效应。前人的试验多是研究某单一因素对花药诱导频率的影响，并且关于采用响应面法优化烟草花药培养的报道尚不多见。因此，笔者在前人研究的基础上，以IAA、6-BA 以及大量元素浓度为考察对象，采用响应面法，试图找到诱导烟草花药胚状体的最佳条件，为优化烟草花药培养体系提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烟草品种为杂交品种♂净叶黄×♀HKDN-5，其中HKDN-5 是由湖南农业大学农学院烟草专业戴林建副教授自育的高钾烤烟材料。杂交组合于2019年3 月移栽至湖南农业大学耘园基地，采用常规田间管理方法，2019 年5 月下旬开始现蕾。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌材料获得 晴天摘取花冠与花萼等长或花冠微微露出的花蕾（此时花药中的小孢子处于单核靠边期），4℃冰箱中预处理一定天数后，将花蕾放入超净台进行消毒。消毒步骤：无菌水冲洗2 次；75%酒精漂洗30 s，无菌水冲洗3 次；20%次氯酸钠和少量吐温20 浸泡15 min，无菌水漂洗4 次；置于无菌滤纸上除湿。用已消毒的镊子拨开花冠，小心取出花药，接种于培养皿中。

1.2.2 大量元素浓度与外源激素添加量对花药胚状体诱导的影响 为了优化烟草花药胚状体诱导的培养基体系，在前期预试验基础上，根据Box-Behnken 中心组合设计对IAA 浓度（A）、6-BA 浓度（B）、大量元素浓度（C）各取3 个水平进行响应面设计。大量元素的浓度以MS 培养基的浓度来体现，设1/4MS，1/2MS和MS这3种基本培养基，外源激素IAA与6-BA分别设0.1、0.5、1 mg/L 这3 个浓度梯度；共有17 个组合（表1），每个组合重复3 次取平均值，若产生污染，则重新接种以保持每个组合均有3 个重复。在基本培养基中加入3%的蔗糖、0.7%琼脂，pH 值调至5.8。暗培养一周后移入光照条件下培养，在上述条件下培养45 d 后统计花药胚状体及愈伤组织的诱导率。

1.2.3 诱导力的测定 花药接种后3 d 观察其污染情况，及时清除污染的培养皿，培养45 d 调查花药胚状体与愈伤组织的诱导率。

1.3 统计分析

以IAA（A）、6-BA（B）、MS 浓度（C）3 个因素作为变量，以胚状体诱导率（Y1）、愈伤组织诱导率（Y2）作为响应量，数据通过design-expert 8.0.6.1软件处理分析并绘图。

2 结果与分析

2.1 烟草花药胚状体诱导条件的优化

2.1.1 试验结果回归分析 对表1 的试验数据进行多元回归拟合，得到花药胚状体诱导率（Y1）对 IAA浓度（A）、6-BA 浓度（B）和大量元素浓度（C）的二次多项回归方程模型：Y1=-6.633 72+88.919 79 A1+46.261 79 B1+50.376 26 C1-18.604 15 A1B1+26.264 18 A1C1-2.252 19 B1C1-95.993 52 A12-37.075 73 B12-55.719 37。愈伤组织诱导率（Y2）对A、B 和C 的二次多项回归方程模型：Y2=-31.531 47+35.988 44 A1+59.713 87 B1+78.585 74 C1+42.389 21 A1B1+27.745 66 A1C1-7.013 49 B1C1-46.429 03 A12-59.566 47 B12-67.576 11 C12。

由表2 和表3 可知，无论是以Y1还是Y2作为响应量，模型都呈极显著（P ＜0.01），仅有0.1%与0.29%的可能性是由未知因素对试验结果造成干扰。这说明模型与实际情况拟合较好，可用于分析花药胚状体和愈伤组织的诱导情况。由表2 可知，一次项A、B 和C 均达显著水平（P ＜0.05），二次项 A2、B2和 C2均达极显著水平，说明IAA 与6-BA 及大量元素的浓度对烟草花药胚状体的诱导均有显著影响；2 种激素浓度交互项差异显著，说明这2 个因素的交互作用亦会对胚状体的诱导产生显著影响。除此之外，IAA 与大量元素浓度间也存在互作效应，二者的交互项差异也达显著水平。分析表3 可得，对烟草花药愈伤组织诱导而言，IAA 与6-BA 的浓度对其有显著影响；而大量元素浓度对愈伤组织诱导的影响则没有前二者显著，IAA 与6-BA 交互项差异显著，说明这2 个因素的交互作用亦对愈伤组织诱导有显著影响。

表2 胚状体诱导（Y1）回归方程模型的方差分析结果

2.1.2 响应面分析 由多元回归方程所作响应面曲线图及等高线图可以直观地反映IAA、6-BA 和大量元素的浓度（MS 浓度）对烟草花药胚状体与愈伤组织诱导的影响。由图1～6 可知，IAA 的浓度对胚状体和愈伤组织诱导的影响最显著，曲线面最陡；6-BA 浓度和大量元素浓度对胚状体和愈伤组织诱导的影响较小，曲线面趋于平缓；在以胚状体诱导率为响应量的分析中，各因素所选范围内均存在极值点；在愈伤 组织诱导率为响应量的分析中，IAA 的浓度仍有上升空间。

表3 愈伤组织诱导（Y2）回归方程模型的方差分析结果

2.3 验证试验

为了进一步验证该模型及测定结果的可靠性，设定胚状体诱导率尽可能大，对方程筛选出的最优条件（0.49 mg/L IAA+0.48 mg/L 6-BA+0.56 MS，此条件下胚状体诱导率的预测值为40.52%）进行10 次试验，烟草花药胚状体诱导率的平均值为36.80%，与预测值仅相差3.72 个百分点，说明该模型较为可靠。

图1 IAA 浓度和6-BA 浓度对胚状体诱导影响的响应面图与等高线

图2 IAA 浓度和MS 浓度对胚状体诱导影响的响应面图与等高线

图3 6-BA 浓度和MS 浓度对胚状体诱导影响的响应面图与等高线

图4 IAA 浓度和6-BA 浓度对愈伤组织诱导影响的响应面图与等高线

图5 IAA 浓度和MS 浓度对愈伤组织诱导影响的响应面图与等高线

图6 6-BA 浓度和MS 浓度对愈伤组织诱导影响的响应面图与等高线

3 讨 论

对于培养条件的优化，传统常用的方法有单因素试验法与正交试验法。单因素试验常用于确定某个因素的使用范围，方法简单，结果明了，也是其他试验设计的基础，但采用此种试验方式容易忽略组分间的交互作用，导致最适宜条件丢失[15]。正交试验法虽研究多因素、多水平的组合，但只能对一个个孤立的试验点进行分析，并不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间一个明确的函数表达式。而该研究采用的响应面法在单因素试验的基础上，通过多元二次回归模型拟合各因素与响应值之间的关系，具有试验次数少、回归方程精度高等特点，同时能克服正交试验只能处理离散水平值，而无法找出最佳组合和响应值的缺陷[16-17]。

利用响应面法能精确分析几个因素之间是否对花药胚状体的诱导具有互作效应。该研究结果表明，试验选取的3 个因素的确对烟草花药胚状体诱导有显著影响。其中，IAA 和6-BA 这2 种激素的浓度对胚状体诱导的影响尤为显著，且2 种激素间存在互作关系，同时互作关系对胚状体与愈伤组织诱导的影响也能达到显著水平。

关于胚状体诱导率预测值与实测值之间相差3.72个百分点的情况，可能是由于烟草为无限花序，采集的花药小孢子处于单核靠边期，但不同开花时期（如现蕾期和盛花期）花药小孢子的活力可能有所差别[18]，导致验证试验结果低于预测值。不过，实际值与预测值之间的差异并不大，且诱导率水平均较高，因此总的来讲该模型可用于烟草花药胚状体诱导进行回归分析和参数优化。

4 结 论

试验通过响应面法得到IAA 浓度、6-BA 浓度、大量元素浓度三者对烟草花药胚状体诱导率与愈伤组织诱导率的二次多项回归方程模型，方差分析结果显示该方程能很好地解释花药胚状体诱导率随各参数变化的规律。

优化后的最佳条件为0.49 mg/L IAA+0.48 mg/L 6-BA+0.56 MS，胚状体的诱导率为36.80%。为了便于实际操作，可采取0.50 mg/LIAA+0.50 mg/L 6-BA+1/2 MS 的条件进行试验。