黔东南州猕猴桃真菌病害种类和病原鉴定

张国辉，李荣玉，李明，顾焕先，李向阳，张文华

(1.凯里学院大健康学院，贵州 凯里 556011；2.贵州大学作物保护研究所，贵州 贵阳 550025；3.凯里市林业局森林植物防治检疫站，贵州 凯里 556000)

猕猴桃ActinidiachinensisPlanch，也称奇异果、藤梨和毛木果等，其果实含K、Zn、Ca等多种矿物元素和多达17种人体所需的氨基酸，具极高的营养价值[1]。中国是猕猴桃的原产地，可分为野生生长区域和人工种植区域，在现有的猕猴桃人工种植区域，大多数品种从野生猕猴桃中挑选培育出来[2]。野生猕猴桃(wild kiwi fruit)，俗名马奶果和猪奶果等，生长在山坡和灌木丛中[3]。野生猕猴桃微量元素的种类和含量以及抗氧化的酚类物质较栽培的猕猴桃品种丰富，蒋天智等对野生猕猴桃微量元素研究的结果表明，野生猕猴桃含有多种有益微量元素且不含重金属元素Ni、Cd、Pb[4-5]。野生猕猴桃果实除鲜食外，也可加工成各种食品和饮料，如果汁、果冻、果脯、果酒和果酱等；此外，其嫩叶和嫩梢可加工成保健茶，根、藤和叶可入药，花可供提取香料。因此，野生猕猴桃具有加工开发利用价值[6]。红心猕猴桃是早熟红心品种，也是药食两用的珍稀品种，经常食用其鲜果对人体有保健、补血养颜和排毒防癌的功效，其营养丰富，富含维生素和多种矿物质及18种氨基酸，被誉为“人间仙果”、“果中之王”和“维C之王”，因其微量元素中的含钙量为果中之首，是中老年人良好的补钙剂。此外，在医疗保健上，红心猕猴桃对高血压、心脑血管病、肝炎、癌症和维C缺乏症等都有医治作用和辅助疗效[7-9]。目前，红心猕猴桃种植已成为适生区农民增收的支柱产业，但由于不少果农缺乏红心猕猴桃的病害知识和科学的防控技术，果园病害日趋严重，严重影响了红心猕猴桃产业的健康发展。已报道的栽培猕猴桃病害有褐斑病[10-14]、根结线虫病[15-18]、炭疽病[19-22]、细菌性叶枯病[23-26]、软腐病[27-28]、根腐病[29]、黑斑病[30]和黄化病[31-34]等，国内尚无野生猕猴桃病害的研究报道。为了解贵州省黔东南州野生猕猴桃和红心猕猴桃产区的病害种类及其病原真菌种类，笔者在该产区进行病害种类调查和室内病原分离鉴定，以期为后期的病害防治提供科技支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料 仪器有超净工作台、移植针、剪刀、镊子、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、显微镜、电磁炉、微波炉等。试剂有0.1%升汞溶液、75%乙醇、无菌水和工业酒精。供试培养基为PSA培养基:去皮马铃薯200 g，切片加水煮沸20 min，过滤，取滤液定容至1 000 mL，加入蔗糖17 g，琼脂17 g，加热溶解，高温灭菌。

1.2 试验方法

1.2.1 病害标本采集和症状观察 2019年10月—2020年5月在贵州省黔东南州凯里市下司镇隆堡村和黔东南州黄平县岑花村半坡组的红心猕猴桃种植基地，田间随机抽取若干行采集病株，同时在基地周边采集野生猕猴病株。观察并描述野生猕猴桃和红心猕猴桃发病部位病斑(病果)的形态、颜色及危害程度等，同时对发病部位进行拍照。记录病害的发生症状，并采集新鲜标本于凯里市林业局检验检疫站做病原分离和鉴定。

1.2.2 病原菌的分离纯化和病原鉴定 应用组织分离法对野生猕猴桃和红心猕猴桃的病叶和病果进行病原菌分离，即用剪刀切取病组织3块，先在0.1%升汞溶液中浸泡2～3 min，再放于75%乙醇浸泡2～3 s，用镊子夹取病组织呈“品”字形放于PSA固体培养基中，最后倒置于恒温培养箱中25℃培养5～7 d。用移植针对长成的菌落进行2次纯化，直至获得纯培养。取纯化后的菌落中央部分的菌丝放于载玻片上，在显微镜下对病原菌的形态特征进行镜检拍照，同时测量记录菌丝和孢子大小。采用核糖体rDNA-ITS(Internal transcribed spacer)区序列分析法进行DNA测序，将ITS区序列测序结果经 GenBank数据库 BLAST比对，使用MEGA4.0软件构建分子进化树，最后结合形态学观察对致病菌进行分类鉴定。

1.3 病原回接 将纯化后的4种病原真菌(胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides、尖孢炭疽菌Colletotrichumacutatum、变红镰刀菌Fusariumincarnatum和互隔交链孢霉Alternariaalternata)先在PSA培养基上培养5～7 d，把无菌水洗下的孢子液配制成浓度为106个/mL的孢子悬浮液，采用针刺法回接在野生猕猴桃、红心猕猴桃的叶片(果实)上。喷雾接种孢子悬浮液，或用打孔器打出直径为5 mm菌丝块，接种在针刺后的叶片(果实)部位。待叶片(果实)产生病斑后，再采用组织分离法对病斑进行分离和纯化，并将分离到的病原菌进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 红心猕猴桃叶片软腐病 叶片发病部位多由叶缘开始变灰褐卷曲，少数病斑位于叶脉间，呈水浸状病斑，后期变成黑色(图1A)。发病部位变薄，略透明(图1B)。PSA平板上，菌落初期呈圆形，白色，绒毛状，菌丝生长旺盛，菌落背面呈淡橙黄色(图1C)，后期菌落产生红褐色色素，菌落背面观呈红褐色(图1D)。分生孢子梗呈粗短状或膨大稍弯曲的小分枝(图1E)，大型分生孢子呈镰刀形，稍弯曲，两端略尖，易脱落。大型分生孢子的隔膜多为4至5个，少数为3个，分隔明显，大小为(21.08～35.28)μm×(3.54～6.19)μm(图1F)。ITS区序列测序结果经GenBank数据库BLAST比对，结合分子进化树的构建结果，菌株与Fusariumincarnatum聚为一类，支持率为100%(图2)，结合形态学确定该致病菌为变红镰刀菌Fusariumincarnatum。

图1 红心猕猴桃叶片软腐病的病叶及病原真菌变红镰刀菌Fusarium incarnatumFig.1 The infected leaf of the soft rot disease on cultivated species of Actinidia chinensis and pathogenic fungus

图2 病原真菌变红镰刀菌Fusarium incarnatum的分子进化树Fig.2 The molecular evolution tree of Fusarium incarnatum

2.2 红心猕猴桃褐斑病 病斑发生于叶片，初期呈水渍状暗绿色小斑，后期病斑沿叶缘或向内扩展，形成不规则的褐色病斑。贵州省黔东南州的梅雨季节里，在多雨高湿条件下，病情扩展迅速，严重时病斑逐渐由褐色变黑色并引起霉烂。正常气候下，褐斑病的病斑边缘呈深褐色，中央颜色略浅(图3A)。病原菌的分生孢子梗褐色，粗壮，单生，有隔膜。孢子链生或单生，卵形、倒梨形或倒棍棒形，大小为(22.50～42.08)μm ×(8.62～13.59)μm，呈褐色，横隔3～4个，斜隔1～4个，分隔处略缢缩(图3B)。ITS区序列测序结果经 GenBank数据库BLAST比对，结合分子进化树的构建结果，菌株与Alternariaalternata聚为一类，支持率100%(图4)，结合形态学确定该致病菌为互隔交链孢霉Alternariaalternata。

图3 红心猕猴桃褐斑病的病叶和病原真菌互隔交链孢霉Alternaria alternataFig.3 The infected leaf of brown spot disease on cultivated species of Actinidia chinensis and pathogenic fungus

图4 病原真菌互隔交链孢霉Alternaria alternate的分子进化树Fig.4 The molecular evolution tree of Alternaria alternate

2.3 红心猕猴桃果实炭疽病 炭疽病症状不仅仅发生在野生猕猴桃的叶片上，还会出现在红心猕猴桃的果实上。果实受害后呈水渍状，病斑圆形，褐色或深褐色，病斑中央略凹陷，边缘清晰，病斑可扩大到整个果面的1/3以上(图5A)。病原菌的分生孢子梭形，大小为(8.85～15.98)μm×(2.60～4.19)μm，两端圆形或一端锐尖，无色，单胞，内含两个油球(图5B)。

图5 红心猕猴桃果实炭疽病的病果和病原真菌尖孢炭疽菌Colletotrichum acutatumFig.5 The infected fruit of anthrax disease on cultivated species of Actinidia chinensis and pathogenic fungus

ITS区序列测序结果经GenBank数据库BLAST比对，结合分子进化树的构建结果，菌株与Colletotrichumacutatum聚为一类，支持率为100%(图6)，结合形态学确定该致病菌为尖孢炭疽菌Colletotrichumacutatum。

图6 病原真菌尖孢炭疽菌Colletotrichum acutatum的分子进化树Fig.6 The molecular evolution tree of Colletotrichum acutatum

2.4 野生猕猴桃炭疽病 野生猕猴桃炭疽病主要以结果初期至落叶时危害较为严重。危害叶片可引起叶斑，发病部位主要在叶缘和叶脉间。叶缘略向叶背卷缩，病斑的病健处交界明显，病斑中间为灰白色至褐色，边缘深褐色，病斑受叶脉限制，呈不规则形，数个病斑连接成不规则灰褐色病斑，严重时形成穿孔(图7A)。病原菌的分生孢子呈圆柱形或近椭圆形，单胞，无色，大小为(13.61～22.58)μm×(3.86～4.20)μm，孢子内有两个油球(图7B)。ITS区序列测序结果经GenBank数据库BLAST比对，结合分子进化树的构建结果，菌株与Colletotrichumgloeosporioides聚为一类，支持率为100%(图8)。结合形态学确定该致病菌为胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides，野生猕猴桃炭疽病为国内首次报道。

图7 野生猕猴桃炭疽病的病叶及病原真菌胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioidesFig.7 The infected leaf of anthrax disease on wild species of Actinidia chinensis and pathogenic fungus

图8 病原真菌胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的分子进化树Fig.8 The molecular evolution tree of Colletotrichum gloeosporioides

2.5 病原回接 将配制好的孢子悬浮液经针刺法接种于红心猕猴桃和野生猕猴桃的叶片(果实)上，孢子悬浮液接种5 d后，4种病原真菌均可导致叶片和果实发病，再采用组织分离法分离病斑(病果)上的病原菌并进行显微鉴定，结果表明再次分离的菌株与接种的病原菌菌株相同(图9)，根据柯赫氏法则，证明接种菌株为野生猕猴桃或红心猕猴桃叶部(果实)病害的致病菌。

3 结论与讨论

大多数栽培猕猴桃品种都是从野生猕猴桃中挑选培育出来的，如红心猕猴桃是红肉猕猴桃的变种，是从野生中华猕猴桃培育出来的。在本次调查研究中，人工种植的红心猕猴桃的病害种类远远多于野生的猕猴桃，现发现的野生猕猴桃病害种类目前只限于叶部，且仅对其果实产生轻微危害，而人工栽培红心猕猴桃的病害种类和数量都较多，且叶果均能发病，对红心猕猴桃果实的生长和成熟都构成威胁。如，猕猴桃果实炭疽病可通过对细胞壁的破坏增大Vc损失率[35]。

本研究中，野生猕猴桃炭疽病和红心猕猴桃叶片软腐病均为国内首次报道。目前各地报道的猕猴桃炭疽病中，病原菌具多样性。浙江省泰顺县和贵州省六盘水市的猕猴桃炭疽病由胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides和博宁炭疽菌Colletotrichumboninense所致[14，20]。江西奉新县猕猴桃果梗炭疽病的病原菌为隔孢丛壳菌Glomerellaseptospora[21]。本研究表明，黔东南州的野生猕猴桃炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides，而红心猕猴桃炭疽病的病原菌为尖孢炭疽菌Colletotrichumacutatum，同一地区，炭疽菌的病原也有可能不同。红心猕猴桃叶片软腐病的病原真菌为变红镰刀菌Fusariumincarnatum，镰刀菌可引起植物的各类腐烂病，如根腐、花腐、茎腐、茎基腐和穗腐等，可造成作物萎蔫死亡，影响其产量和品质，软腐病是生产上防治最难的重要病害之一。目前已有研究结果表明，贵长猕猴桃的腐烂果中分离到的是小新壳梭孢菌Neofusicoccumparvum、拟茎点霉Phomopsissp.和尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum，其中小新壳梭孢菌和拟茎点霉是贵长猕猴桃腐烂的主要病原菌[36]。Fusariumsolani是腐生性较强的真菌，属于次生寄生菌，可加重广东省和平县的猕猴桃根腐病发生[29]。通过‘秦美’猕猴桃贮藏期病原真菌的鉴定发现，三线镰刀菌Fusariumtricinctum也不是优势病原菌[37]。质量浓度为0.3 mg/mL的银杏叶提取液对镰刀菌属的抑制率达到98.3%[38]。大蒜素对猕猴桃果实主要致病菌层出镰刀菌Fusariumproliferatum菌丝生长的抑制中浓度(EC50)为1 048.63 mg/L[39]。猕猴桃褐斑病是猕猴桃生长期最严重的叶部病害之一，对产量和鲜果品质影响很大。黔东南州红心猕猴桃褐斑病的病原菌为互隔交链孢霉Alternariaalternata。猕猴桃褐斑病在叶片和果实上均可发病，且贯穿于猕猴桃整个生长季，给地方产业发展造成了较大的危害[10-11]。值得一提的是，在现已发表的文章里，猕猴桃黑斑病和猕猴桃褐斑病的命名虽不同但病原相同，如奉新县猕猴桃黑斑病的病原为Alternariaalternata[40]，与褐斑病的病原相同，只是病害名称有差异，根据病原菌鉴定结果，2种病害的病原菌实际上为同一种病原菌Alternariaalternata。2017—2018年，中国科学院武汉植物园猕猴桃种质资源与育种学科组对贵州省六盘水市、浙江省温州市泰顺县及云南省屏边县猕猴桃病虫害情况进行了周年调研。在猕猴桃病害鉴定过程中，首次发现细极链格孢菌菌株Alternariatenuissima可导致褐斑病症状，球黑孢菌株Nigrospora sphaerica导致软腐病症状，Didymellaglomerata菌株为黑斑病的致病菌[30]，为猕猴桃病害命名有了一个明确的说明。