miR-198过表达抑制视网膜母细胞瘤生长及侵袭的实验研究

赵 鑫，胥 朵，李少海，张文信 (.渭南职业技术学院西医临床教研室，陕西 渭南 7406;.渭南市中医医院骨科，陕西 渭南 7406)

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)作为儿科比较常见的一种眼内恶性肿瘤，全球范围的发病率为1/20 000[1]。RB在非洲及一些发展中国家的发病率较高，并且患儿的5年生存率要低于发达国家[2]。RB发现越早其治愈的可能性越高，由于发病初期肿瘤体积小，并位于视网膜周边，不会有明显的视力影响，而一旦出现眼部症状后，治愈的可能性则明显降低[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类具有调控功能的非编码RNA，其核苷酸序列长度一般为19～25 bp，在细胞的增殖、分化及凋亡过程中发挥着重要的作用[4]。近年来大量实验研究证实,miRNA可作为原癌基因或抑癌基因参与到肿瘤的发生及进展中，因此miRNA具有成为治疗癌症靶点的潜在价值[5]。既往研究发现，miR-198能够通过抑制HGF/c-MET信号途径提高非小细胞肺癌的放疗敏感性，诱导细胞凋亡[6],并且能够通过调节ADAM28/JAK-STAT信号通路影响大肠癌的增殖和凋亡[7]，还能够抑制TLR4蛋白表达及胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[8]，但miR-198在RB细胞中的调控机制尚未明确。因此本研究通过在RB细胞株系Y79细胞中转染miR-198模拟物，以探究miR-198对RB细胞生长、侵袭的影响，并进行裸鼠体内荷瘤试验，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

miR-198 mimic及miR-NC(上海吉凯基因技术有限公司)，脂质体、Lipofectamine®2000(美国Thermo Fisher Scientific)，10%胎牛血清(美国Gibco公司)，100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素(美国Invitrogen公司)，TRIzol Kit、Revertaid First Strand cDNA Kit(Thermo Fisher科学公司)，兔抗人Ki67、SOX2、OCT4、VEGF、Fibronectin、GAPDH以及兔抗小鼠Ki67、SOX2、VEGF单克隆抗体(美国Abcam公司)，细胞计数试剂盒(碧云天公司)，铺有Matrigel胶的Transwell小室(美国BD公司)，高速冷冻离心机(德国Beckman Coulter)，正置荧光显微镜(日本Thermo)，实时荧光定量PCR仪(罗氏诊断)。

1.2 细胞培养及分组

RB Y79细胞株购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，将其培养于含10%胎牛血清、1%双抗的完全RPMI 1640培养液中，并在37 ℃的5%CO2加湿培养箱中培养至对数期，随后以0.25%胰蛋白酶消化液处理制成细胞悬液。将细胞悬液随机分为空白对照组(Control组)、阴性对照组和过表达组，参照试剂盒操作说明采用Lipofectamine®2000将miR-NC、miR-198模拟物分别转染至阴性对照组和过表达组的Y79细胞中，继续培养48 h，然后置于荧光显微镜下观察转染阳性细胞，若发出绿色荧光信号则视为转染阳性，收集细胞用于后续实验。

1.3 qRT-PCR检测细胞中miR-198表达水平

Trizol法提取各组中的总RNA，并进行琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，利用Revertaid First Strand cDNA合成试剂盒将RNA反转录合成cDNA，采用SYBR-Green PCR Mix试剂盒检测mRNA的表达水平。PCR参数设置：95 ℃预变性20 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸20 s，循环40次，并根据溶解曲线分析结果是否为特异性扩增。miR-198上游引物：5′-GGTCCAGAGGGGAGAT-3′；下游引物：5′-GAATACCTCGGACCCTGC-3′。内参基因U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′；下游引物：5′-AACGATTCACGAATTTGCGT-3′。应用2-△△Ct法分析miR-198的相对表达水平。

1.4 干细胞成球试验检测Y79细胞增殖能力

将各组Y79细胞消化后计数，调整浓度至1×105/mL,接种至6孔板上，加入含有2%胎牛血清、10 μg/mL胰岛素、20 ng/mL表皮生长因子、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20 ng/mL B27细胞培养添加剂、500 ng/mL氢化可的松的干细胞培养液后，放入37 ℃的5%CO2加湿培养箱中培养96 h，之后在光学显微镜下观察干细胞成球的直径及数量，并拍照记录。

1.5 Transwell小室试验检测Y79细胞侵袭能力

将铺有Matrigel胶的Transwell小室预热至37 ℃后，消化各组Y79细胞，用无血清培养液洗涤细胞 3次后重悬细胞，并调整细胞密度至1×105/mL，在Transwell下室放入1 mL含10%胎牛血清的培养液，上室加入300 μL细胞悬液后培养36 h。取出Transwell小室，用棉签轻柔地擦去上层未穿膜的细胞和基质胶，用冰甲醛对滤膜进行固定后结晶紫染色。将滤膜剥离后正面朝下固定在载玻片上，在光学显微镜下随机选择5个高倍镜(×400)下视野进行细胞计数，以穿膜细胞数表示细胞侵袭能力。

1.6 Western blot检测细胞中相关蛋白表达水平

加入RIPA裂解液，提取各组培养48 h后的Y79细胞中的总蛋白，采用BCA法对蛋白水平进行定量，并利用Bradford将各组蛋白浓度调整一致，经SDS-PAGE凝胶电泳、电转膜至甲醛预处理过的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗人Ki67、SOX2、OCT4、VEGF、Fibronectin、GAPDH一抗(1∶500)，于4 ℃孵育过夜，TBST漂洗40 min，加入HRP标记的二抗(1∶500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL试剂盒与DNR BioImaging System观察膜上蛋白条带，收集影像，采用凝胶图像处理系统软件分析各组条带灰度值，依据相对灰度值进行统计学分析。

1.7 裸鼠体内移植实验

将适应性培养的60只裸鼠随机分为阴性对照组和过表达组，每组30只，收集2组对数生长期的Y79细胞，制成密度为1×1010/L的细胞悬液后，分别进行皮下注射，每只裸鼠注射200 μL，注射完成后，每5 d各组随机处死3只裸鼠，取瘤体测量质量及体积，30 d时处死剩余裸鼠，取平均值计算。瘤体中miR-198的mRNA相对表达水平检测同1.3。所有操作均符合动物实验伦理标准。

1.8 免疫组化法检测瘤体中蛋白表达水平

将瘤体组织进行常规石蜡切片，脱水、PBS溶液漂洗、3%H2O2与甲醇混合液浸泡10 min，超纯水漂洗、抗原修复、PBS漂洗5 min、加入一抗37 ℃反应2 h、PBS漂洗5 min、加入二抗37 ℃反应40 min、PBS漂洗5 min、DAB室温显色20～30 min，光学显微镜下观察有棕黄色颗粒出现时则采用自来水终止。再用苏木素复染30 s、自来水漂洗、中性树胶封片，光学显微镜下观察切片中Ki67、SOX2、VEGF的阳性表达细胞，其细胞浆表现为棕黄色颗粒。每张切片随机选取10个视野，统计阳性细胞数目，计算阳性细胞率，阳性细胞率=阳性细胞数目/总细胞计数×100%。

1.9 统计学分析

所有实验所得数据均采用SPSS 20.0以及Graph Pad Prism 5进行统计学分析，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染试验结果

qRT-PCR结果显示，阴性对照组与Control组Y79细胞中miR-198的相对表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而过表达组Y79细胞中miR-198的相对表达水平较Control组及阴性对照组提高了58倍，差异有统计学意义(P<0.05)，表明过表达miR-198成功(图1)。

*：与过表达组比较，P<0.05

2.2 过表达miR-198抑制Y79细胞增殖能力

干细胞成球试验结果显示，阴性对照组与Control组Y79细胞的成球直径及数量比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而过表达组Y79细胞的成球直径及数量较Control组及阴性对照组小，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3 过表达miR-198抑制Y79细胞侵袭能力

Transwell试验结果显示，阴性对照组与Control组Y79细胞的细胞侵袭率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而过表达组Y79细胞的细胞侵袭率较Control组及阴性对照组低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

a：各组Y79细胞干细胞成球试验结果(×400)；b：各组Y79细胞的成球直径和数量 *：与过表达组比较，P<0.05

a：各组Y79细胞Transwell试验结果(结晶紫，×400)；b：各组Y79细胞侵袭情况 *：与过表达组比较，P<0.05

2.4 过表达miR-198抑制Y79细胞Ki67、SOX2、OCT4、VEGF、Fibronectin蛋白表达

Western blot结果显示，阴性对照组与Control组Y79细胞中Ki67、SOX2、OCT4、VEGF、Fibronectin蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而过表达组Y79细胞中Ki67、SOX2、OCT4、VEGF、Fibronectin蛋白表达水平较Control组及阴性对照组低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4、5。

a：蛋白表达图谱；b：各组Y79细胞中Ki67、SOX2、OCT4蛋白表达水平 *：与过表达组比较，P<0.05

a：蛋白表达图谱；b：各组Y79细胞中VEGF、Fibronectin蛋白表达水平 *：与过表达组比较，P<0.05

2.5 过表达miR-198抑制Y79移植瘤体形成

过表达组裸鼠的移植瘤体质量和体积均小于阴性对照组(P<0.05)，见图6a～c。qRT-PCR结果显示，过表达组裸鼠的移植瘤中miR-198相对表达水平高于阴性对照组(P<0.05)，见图6d。免疫组化检测显示，过表达组裸鼠的移植瘤中Ki67、SOX2、VEGF的阳性表达率低于阴性对照组(P<0.05)，见图7。

a：皮下注射后30 d裸鼠移植瘤；b：皮下注射后不同时间点移植瘤体积；c：皮下注射30 d裸鼠移植瘤体质量；d：移植瘤中miR-198的相对表达水平 *：与阴性对照组比较，P<0.05

*：与阴性对照组比较，P<0.05

3 讨论

RB是一类由于RB1基因发生突变而导致的儿童眼内恶性肿瘤，近年来其临床治疗效果取得了巨大的进步，但在世界范围内RB的病死率及继发肿瘤率依旧较高，早发现、早治疗及遗传咨询是控制该病的关键[9]。鉴于临床上对患儿生存质量重视程度的不断提高，RB治疗的目标逐渐由保障患儿生命转变为保留眼球甚至视力，因此对其治疗方案的选择提出了更高的要求[10]。常规化疗联合局部治疗是临床上最常用的方式，随着医疗技术的不断发展及RB病因学的深入研究，基因疗法、干细胞疗法、靶向治疗等方式逐渐应用于临床[11]。miRNA作为单链短RNA，不具备开放阅读框，因此不能进行翻译蛋白表达，但能够通过与靶基因的3′或5′段UTR区完全或不完全结合来进行表达的调控[12]。目前人类基因组中已经发现超过1 000种的miRNA，其不仅参与调控细胞的正常增殖凋亡过程，在肿瘤发生发展过程中也发挥着重要的作用，已成为了世界范围内研究的热点方向之一[13]。

miRNA在体内既能够作为原癌基因促进肿瘤的发生发展，又能够作为抑癌基因抑制肿瘤的进展[14]。miR-198作为一类抑癌基因，在多种癌细胞中低表达[15-16]，并且其表达水平与结直肠癌和胰腺导管腺癌患者的预后密切相关[17-18]。为了探究miR-198在RB中的可能机制，本研究选择RB Y79细胞系为研究对象，并通过转染miR-198模拟物获得过表达细胞系，经RT-PCR试验证实转染miR-198模拟物后，Y79细胞内的miR-198表达水平升高了58倍。细胞的过度分裂及增殖是肿瘤癌变的重要环节，Ki67作为增殖性细胞核的标志物，在细胞分裂G1后期、G2期和S期表达逐渐升高，在M期表达量达到最高峰，因此Ki67是评价细胞增殖的敏感指标[19]。本研究显示，过表达组Y79细胞内Ki67表达水平明显降低，提示miR-198可能通过抑制肿瘤细胞的分裂，从而抑制细胞增殖。SOX家族具有高迁移率族蛋白结合区域，SOX2作为家族的重要成员之一，参与调控组织器官的形成以及发展，在维持干细胞特性方面具有重要作用；OCT4作为一类转录调节因子，能够维持干细胞的多潜能性以及未分化状态[20]。既往研究发现，在人类胚胎干细胞自我更新时miR-145呈现低表达，而在分化时miR-145能够通过抑制SOX2及OCT4的表达从而促进细胞分化[21]。本研究过表达组Y79细胞的干细胞成球能力明显降低，且SOX2、OCT4蛋白表达水平也明显降低，提示miR-198可能通过抑制SOX2、OCT4蛋白表达，从而降低Y79细胞的干细胞特征，进而抑制其恶性增殖。

侵袭、转移是恶性肿瘤的重要生物学特征[22]。VEGF能够增加血管的通透性，导致肿瘤细胞侵入血管，进而向淋巴及远处细胞侵袭转移[23]。Fibronectin蛋白作为间质细胞源性标志物，其水平升高表明细胞发生上皮间质转化，而间质细胞的增加会使得肿瘤细胞的形态发生改变，其侵袭及迁移能力明显提高[24]。本研究显示，过表达组Y79细胞中VEGF、Fibronectin蛋白水平明显降低，提示miR-198可能通过抑制Y79细胞的上皮间质转化进程，进而抑制肿瘤细胞的侵袭能力，与Hu等[25]的研究一致。本研究通过移植瘤实验进一步证实了在体内过表达miR-198后能够明显抑制移植瘤的生长，并且肿瘤组织中Ki67、SOX2、VEGF蛋白的阳性表达率均明显降低，提示在体内miR-198同样能够发挥抑制肿瘤生长、侵袭的作用。

综上所述，miR-198在RB细胞中同样作为抑癌基因发挥作用，在RB细胞系Y79细胞中过表达后，细胞的增殖能力及侵袭能力均明显降低，可能是通过调控细胞周期、降低干细胞特性、抑制上皮间质转化来实现的，同时移植瘤实验也证实了其抑制肿瘤的潜在价值。本研究初步探索了miR-198对RB细胞的作用机制，为RB细胞的基因治疗提供了新的治疗靶标。