黑木耳银耳山楂复配对高脂血症大鼠血脂代谢的影响

2021-01-28杨新白利琴李研东赵丹丹刘新明陶清泉郝建雄陈浩然牟德华李丹丹韩雪

食品研究与开发 2021年2期

杨新，白利琴，李研东，赵丹丹，刘新明，陶清泉，郝建雄，陈浩然，牟德华，李丹丹，韩雪*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄 050018；2.河北省兽药监察所，河北石家庄 050000；3.承德神栗食品股份有限公司，河北承德 067600；4.承德本多宝生物科技有限公司，河北承德 067600）

高脂血症是指人体中脂质代谢异常，血浆里脂质中的一种或多种成分的浓度超过正常高限的病症。现代医学认为造成心脑血管疾病的直接原因是动脉粥样硬化，而高血脂和脂质代谢紊乱是动脉粥样硬化形成的主要动因，最终引发脑出血、血栓和心肌梗塞而导致死亡[1]。近年来，随着人们生活水平的提高和生活习惯的改变，我国高脂血症的发病率明显增加，患者逐渐趋向年轻化。临床上常采用贝特类药和他汀类药预防和治疗高脂血症，效果良好，但难免有副作用[2-3]。因此，在无副作用的前提下，预防血脂代谢异常，防治高脂血症，乃至预防心脑血管疾病，具有重要的理论价值和现实意义。

黑木耳（Auricularia auricular）是一种药食两用的真菌，黑木耳的生物活性主要来自其中的多糖，黑木耳多糖具有抗氧化活性、抗凝血活性、降低血糖、降血脂、抗肿瘤、抗凝血、抗辐射等多种生物活性，并且可以改善健康[4]。银耳是一种经济价值高，营养丰富的胶质食用菌和药用菌[5]，粗多糖是银耳主要的功能性成分，据国内外的药理作用研究，银耳多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化衰老、降血糖血脂、抗凝血血栓、抗溃疡、促进蛋白质合成、抗病毒、促进神经细胞生长及改善记忆力等多方面的活性[6]。山楂一直被当作为“药食同源”的上等补品，山楂果实已被中华人民共和国卫生部批准为功能性食品原料，并已被中国药典收录为中草药[7]。山楂含有多种生物活性物质，其中多酚是一类最重要、最有效的成分。关于黑木耳多糖、银耳多糖、山楂黄酮提取物的降脂作用研究已有大量的文献报道，但是对这3种物质进行混合配比，研究其整体对实验体的血脂及抗氧化等生物物理指标的影响鲜有报道。

本研究采用高脂饲料喂养大鼠并建立大鼠高脂血症模型，对大鼠进行预防性治疗，首次将黑木耳多糖、银耳多糖、山楂黄酮提取物三者进行复合配制，主要对其关于降血脂功效进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPF级雄性Wistar大鼠：河北医科大学实验动物中心，体质量（200±20）g，许可证 SCXK（冀）2018-004；黑木耳、银耳、山楂：市售；血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、血清甘油三酯（triglyceride，TG）、血清高密度脂蛋白胆固醇（high density liptein cholesterol，HDLC）、血清低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷草转氨酶（aspartate amino transferase，AST）、谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；考马斯亮蓝G-250、乙醇、浓硫酸、4%多聚甲醛通用型组织固定液、氯化钠注射液等（分析纯）：北京奥博星生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

高速万能打粉机（FSJ302-5）：天津市泰斯特仪器有限公司；超声波发生装置（KQ2200）：昆山市超声仪器有限公司；离心机（LXJ-IIB）、电子天平（FA2204B）：上海市安亭电子仪器厂；酶标仪（S/N601-1037）：德国BMG；旋转蒸发仪（RE52CS-1）：上海亚荣生化仪器厂；电热鼓风干燥箱（GZX-9070）、生化培养箱（BSP-250）：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；超低温冰箱（902）：Thermo Fisher Scientific；组织匀浆机（JX-24）：上海净信实业发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取物的制备

黑木耳多糖、银耳多糖采用水提醇沉的方法进行提取[8]，山楂黄酮用乙醇进行提取[9]。

1.3.2 饲料配方

高脂饲料配方：基础饲料78.8%、猪油10%、蛋黄粉10%、胆固醇1%、胆酸盐0.2%[10]。

1.3.3 动物分组、给药及处理

所有动物饲养一周适应环境，根据体重将大鼠随机分为10组，对大鼠进行预防性治疗，在自由采食高脂饲料的同时进行灌胃，连续给药5周，具体处理方式见表1。

表1 实验设计方案Table 1 Experimental design scheme

在第35天禁食12 h后，大鼠股动脉取血，3000r/min离心15 min分离出血清，用于血脂指标和抗氧化指标的测定。解剖大鼠，迅速取出脑、心脏、脾脏及肾脏，剔除其表面的脂肪膜，用生理盐水冲洗干净，用滤纸将水分吸去，然后称重，置洁净塑料盒内密封，血清和各脏器保存于-80℃冰箱，备用。

1.3.4 检测指标

1.3.4.1 体重及采食量

每周记录动物体重及采食量。

1.3.4.2 血清中各生化指标测定

将各组大鼠血清按照每种试剂盒的说明书规范操作，检测以下生化指标：TC、TG、HDL-C、LDL-C、MDA、CAT、SOD、GSH-Px、ALT 和 AST，并可根据公式计算出动脉硬化指数（AI）值：AI=TC-（HDL-C）/HDL-C[11]。

1.3.4.3 脑、肝脏组织抗氧化指标检测

按照试剂盒说明书操作步骤，测定脑、肝脏组织中MDA含量、CAT活性、SOD活性和GSH-Px活性。

1.3.4.4 脏器系数计算

脏器系数（%）=脏器质量×100/大鼠体重

1.3.4.5 脂肪湿重和脂肪系数

动物取血后，解剖剥离其肾周及生殖器周脂肪组织，称脂肪重量，计算脂肪系数。

脂肪系数/%=脂肪湿重（g）/体重（g）×100

1.3.4.6 肝脏组织病理学的检查

取相同部位（肝小叶）大鼠肝脏浸泡至4%多聚甲醛固定液中，然后进行脱水、石蜡包埋并切片，HE染色后放置于光学显微镜下，观察其结构和变性。

1.4 统计分析

实验数据采用Excel和SPSS19.0进行统计分析，数据用均数±标准差（±s）表示，组间比较并进行Duncan’s检验，P＜0.05表示具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 黑木耳多糖、银耳多糖、山楂黄酮复配物对大鼠体重增量、饲料采食量的影响

黑木耳银耳山楂提取物对大鼠体重增量、饲料采食量的影响见表2。

表2 黑木耳银耳山楂提取物对大鼠体重增量、饲料采食量的影响Table 2 Effect of extract on Auricularia auricula,Tremella fuciformis,hawthorn on body weight gain and feed intake of rats

由表2可知，与高脂模型相比，单剂量组和低中高复配物组体重增量有降低的趋势，但是差异并不显著（P＞0.05），中高剂量复配物组比单剂量组体重增量降低趋势更明显，中高剂量复配组体重增量仅为68.8 g和72.56 g，各组之间采食量几乎没有差异。模型组体重增量与空白组相比，显著升高（P＜0.05），说明长期食用高脂饲料会造成大鼠体重较为明显的增长。与Zou等[12]、靳振刚等[13]的研究结果一致。

2.2 黑木耳多糖、银耳多糖、山楂黄酮复配物对大鼠脂肪组织的影响

黑木耳银耳山楂提取物对大鼠脂肪系数的影响见表3。

表3 黑木耳银耳山楂提取物对大鼠脂肪系数的影响Table 3 Effect of extract Auricularia auricula,Tremella fuciformis,hawthorn on fat coefficient of rats

与空白组比较，模型组的附睾脂肪系数、肾周脂肪系数和总脂肪系数均有增加，且有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。与模型组相比，非诺贝特组与高剂量复配物组对肾周脂肪系数具有降低作用，且具有极显著性差异（P<0.01），分别降低了22%、21.3%；银耳多糖组、山楂黄酮组、低剂量复配物组对肾周脂肪系数也具有降低作用，且具有显著性差异（P<0.05）。

与模型组相比，各组的附睾脂肪系数均有降低，高剂量复配物组较单剂量及低中剂量复配物组降低效果更明显，下降21.5%，具有极显著性差异（P<0.01）。与模型组相比，各组的总脂肪系数均有降低，但只有非诺贝特组与高剂量复配物组的差异具有统计学意义（P<0.05），仅为3.85%、3.83%，由此可以说明高剂量组复配物可能有减肥作用。

2.3 黑木耳多糖、银耳多糖、山楂黄酮复配物对大鼠脏器系数的影响

黑木耳银耳山楂提取物对大鼠肝脏系数的影响见表4。

表4 黑木耳银耳山楂提取物对大鼠肝脏系数的影响Table 4 Effect of extract of Auricularia auricula,Tremella fuciformis,hawthorn on liver coefficient in rats

肝脏和脾脏系数增大，这表明喂养高脂饲料会造成大鼠肝损伤和脾损伤[14]。与空白组相比，模型组肝脏系数增加，且具有显著性差异（P＜0.05）；非诺贝特组肝脏系数增加更为明显，具有极显著性差异（P<0.01），说明此药物在降低血脂的同时，对肝脏产生明显的损害作用。与模型组相比，高剂量复配物组肝脏系数具有显著性差异（P＜0.05），降低了11.9%。相比于模型组，辛伐他汀组、单剂量组、低中高剂量复配物组大鼠的脾脏系数明显降低，且高剂量复配物组脾脏指数降低显著，降低了20.8%。随着剂量的增加，实验组大鼠的肝脏和脾脏指数逐渐减小，体现出了一定的剂量依赖性。这与目前相关研究结果一致，在张名位[15]、肖新峰等[16]研究中，高脂饲料都显著提高了受试动物的肝脏和脾脏系数。本研究中各组大鼠心脏、肾脏系数均无显著差别，说明各组大鼠内脏并无严重受损，这与陈桂林[17]对绞股蓝降血脂功能的研究中出现的结果相似。

2.4 黑木耳多糖、银耳多糖、山楂黄酮复配物对大鼠血脂水平的影响

黑木耳银耳山楂提取物对大鼠血脂水平的影响见表5。

表5 黑木耳银耳山楂提取物对大鼠血脂水平的影响Table 5 Effect of extract of Auricularia auricula,Tremella fuciformis,hawthorn on serum lipid level in rats

各剂量对实验大鼠的血脂水平具有不同程度的影响。与空白组比较，模型组的TC、TG、LDL均显著性提高（P＜0.01），HDL 显著性降低（P＜0.01），说明高脂模型组大鼠造模成功。与模型组相比，单剂量组、阳性对照组、低中高剂量复配物组的TC、TG均显著降低，非诺贝特组、中高剂量复配物组较模型组相比TC含量分别降低了28.9%、24.1%、23%。高剂量复配物组、辛伐他汀组较模型组相比TG含量分别降低了36.2%，30.5%。可见复配物对血脂的影响呈现一定的剂量依赖性。

与模型组（0.45±0.10 mmol/L）相比，只有辛伐他汀组（0.60±0.07 mmol/L）与高剂量复配物组（0.63±0.10 mmol/L）HDL-C 的含量显著升高（P＜0.05），其余组有升高的趋势，但差异不具有统计学意义（P＞0.05）；只有非诺贝特组与中剂量复配物组LDL-C的含量显著降低，其余组有降低的趋势，但差异不具有统计学意义（P＞0.05）。

随着大鼠血脂的改变，各组大鼠的AI值均出现了不同的变化。模型组的值高达4.38±1.51，具有较高的动脉粥样硬化风险，通过给药治疗后，低中高剂量复配物组大鼠的AI值分别下降了30.8%、30.1%、41.6%。而单剂量组只有黑木耳多糖组呈显著性降低，山楂黄酮组、银耳多糖组均没有显著性差异，说明黑木耳银耳山楂提取物复配很可能有降低实验大鼠患动脉粥样硬化的风险。

2.5 黑木耳多糖、银耳多糖、山楂黄酮复配物对大鼠抗氧化水平的影响

2.5.1 肝脏抗氧化能力分析

黑木耳银耳山楂提取物对大鼠肝脏抗氧化能力的影响见表6。

表6 黑木耳银耳山楂提取物对大鼠肝脏抗氧化能力的影响Table 6 Effect of extract of Auricularia auricula,Tremella fuciformis,hawthorn on antioxidant capacity of rat liver

如表6所示，模型组大鼠肝脏MDA含量显著高于空白组（P＜0.05），CAT活性和GSH-Px活性显著低于对照组（P<0.05），SOD活性虽低于空白组，但没有统计学差异（P>0.05）。山楂黄酮单剂量组、低、高剂量组肝脏GSH-Px活性显著高于模型组。各组大鼠肝脏CAT、SOD活性虽然差别很大，但因为个体差异较大而无统计学意义。与模型组相比，非诺贝特药物组CAT活力显著增强，MDA含量显著降低（P＜0.05）。

2.5.2 血清抗氧化能力分析

黑木耳银耳山楂提取物对大鼠血清抗氧化能力的影响见表7。

表7 黑木耳银耳山楂提取物对大鼠血清抗氧化能力的影响Table 7 Effect of extract of Auricularia auricula,Tremella fuciformis,hawthorn on antioxidant activity of rat serum

如表7所示，模型组大鼠血清CAT活性极显著低于空白组（P<0.01），SOD活性显著低于空白组（P<0.05），GSH-Px活性虽低于空白组，MDA含量虽高于空白组，但没有统计学差异（P>0.05）。中剂量复配物组血清CAT活性（7.41±4.51）U/mL显著高于模型组（3.73±0.34）U/mL（P<0.05），高剂量复配物组血清 SOD（484.02±56.58）活性显著高于模型组（401.18±24.95）（P<0.05）。与模型组相比，非诺贝特组CAT活性显著增强，MDA含量显著降低（P<0.05），但其GSH-Px活性却远远低于空白组（P<0.01）。

2.5.3 脑抗氧化能力分析

黑木耳银耳山楂提取物对大鼠脑组织抗氧化能力的影响见表8。

表8 黑木耳银耳山楂提取物对大鼠脑组织抗氧化能力的影响Table 8 Effects of extract of Auricularia auricula,Tremella fuciformis,hawthorn on antioxidant capacity of brain tissue in rats

如表8所示，模型组大鼠脑组织MDA含量显著高于空白组（P＜0.05），GSH-Px活性显著低于对照组（P<0.05），CAT活性和SOD活性虽低于空白组，但没有统计学差异（P>0.05）。中剂量复配物组GSH-Px活性（24.28±5.25）显著高于模型组（17.77±1.32）U/mg，高剂量复配物组MDA含量（0.75±0.14）nmol/mg显著低于模型组（1.10±0.14）nmol/mg（P<0.05）。

2.6 黑木耳多糖、银耳多糖、山楂黄酮复配物对大鼠肝损伤的影响

黑木耳银耳山楂提取物对大鼠血清中ALT、AST活力的影响见表9。

表9 黑木耳银耳山楂提取物对大鼠血清中ALT、AST活力的影响Table 9 Effect of extract of Auricularia auricula,Tremella fuciformis,hawthorn on serum ALT and AST activity in rats

由表9可知，与空白组相比，模型组大鼠血清中ALT、AST酶活力均显著性升高（P<0.05）。经过给予药物干预后，辛伐他汀阳性药物组、低中高剂量复配物组大鼠血清中的AST、ALT酶活力均显著下降（P<0.05或P<0.01），而银耳多糖组、山楂黄酮组这两个单剂量组大鼠的两项相应指标均未产生显著性差异（P>0.05），说明黑木耳银耳山楂提取物联合使用对肝脏有保护作用。

2.7 大鼠肝脏的病理变化

大鼠肝脏组织形态学分析见图1。

光镜检查发现：空白组肝脏组织结构清晰，肝细胞索状排列，肝窦无明显扩张或狭窄，肝细胞核居中，胞浆丰富，胞膜清晰，肝细胞内未见脂肪空泡细胞核位于细胞中央；模型组肝窦明显狭窄，肝索排列较紊乱，部分肝细胞中出现大小不等的脂肪空泡核固缩。给药后肝组织结构较模型组变清晰，辛伐他汀、非诺贝特组以及各单剂量组、低剂量复配组肝索排列较空白组紊乱，以中高剂量复配物组干预效果最为明显。

图1 大鼠肝脏组织形态学分析（HE染色，×400）Fig.1 Histomorphological analysis of rat liver（HE staining，×400）

3 讨论

高血脂症即为血脂紊乱或血脂异常，是指人体内血清脂质的浓度超出了正常范围，包括血清总胆固醇（TC）水平升高、血清甘油三酯（TG）水平升高、血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平降低等，是心脑血管疾病的主要危险因素之一。本实验以Wistar雄性大鼠为研究对象，采用高脂饲料喂养法建立高脂模型，具有饲养方便、抵抗力强，食性与人相近等优点[18]。

实验结果表明，模型组与空白组相比较，体重增量、TC、TG、LDL均显著升高，HDL-C显著降低，表明本实验高脂血症模型建立成功。根据医学研究表明，血清中TC、TG、LDL-C含量的升高和HDL-C含量的降低更容易诱发动脉粥样硬化和心脑血管疾病[19]。HDL-C是将肝脏组织外的胆固醇逆向转运回肝脏的主要形式，而LDL-C是将肝脏合成的胆固醇转运到全身组织的主要形式。通过对试验数据分析得到，只有高剂量组高密度脂蛋白与模型组形成显著性差异，推测高剂量组可能是提高HDL-C的含量，从而降低血清中TC、TG、LDL-C水平，达到降低血脂的目的。这与单科开等[20]对苦菜黄酮降血脂功能的研究中出现的结果相似。

肝脏损伤与其代谢异常密切相关，其中脂质代谢紊乱是肝脏损伤的一个重要因素。ALT主要分布在肝细胞浆，AST主要分布在肝细胞浆和肝细胞的线粒体中。肝细胞坏死时ALT和AST就会升高[21]。根据数据分析得到，与模型组比较，辛伐他汀组、低中高剂量复配物组大鼠血清中的AST、ALT酶活力均显著下降（P<0.05或P<0.01），而银耳多糖组、山楂黄酮组这两个单剂量组大鼠的两项相应指标均未产生显著性差异（P>0.05）。说明黑木耳多糖、银耳多糖、山楂黄酮联合作用对肝脏有保护作用。

肝脏系数能反应肝脏的损伤程度，肝脏系数增大说明肝脏组织发生增生肥大或水肿等。结合肝组织形态学观察结果发现，过多的油脂摄入使脂肪积累，造成肝脏负担加重或病变，肝脏质量增加，从而使肝脏系数增加。本实验中各实验组肝脏系数均较空白组高，与模型组相比，辛伐他汀组及各单剂量组、低中高剂量复配物组的肝脏系数均有降低，且高剂量复配物组差异有统计学意义（P<0.05），说明高剂量组能够改善肝脏组织。通过动物肝脏细胞病理切片可知，中高剂量复配物组能有效地减少脂肪空泡，肝索细胞排列较整齐，改善肝脏组织，对高血脂症具有一定的治疗效果，在一定程度上能减轻病变。

在食用高脂食物过程中，会造成机体血脂异常，血脂异常会导致机体抗氧化能力下降，氧自由基生成增加，脂质过氧化作用增强[22]。SOD、GSH-Px和CAT是体内重要的三大酶类抗氧化剂，SOD能使超氧自由基歧化为过氧化氢和氧，CAT可使过氧化氢分解成为水和氧，GSH-Px可催化还原型的谷胱甘肽转变为氧化型的谷胱甘肽，从而消除细胞中的有机或无机的过氧化物。丙二醛（MDA）是脂质过氧化反应链终止阶段产生的小分子产物，对细胞膜有严重的破环作用，机体中MDA的水平可以间接反映机体组织细胞的过氧化程度[23]。本实验结果表明，低中高剂量复配物组能不同程度抑制血清、脑和肝脏组织中SOD和GSH-Px，使之活力下降，其量效关系均呈正相关，提示黑木耳多糖、银耳多糖、山楂黄酮联合作用可通过增强体内抗氧化系统发挥抗氧化作用。