基于花粉形态及DNA条形码的中华蜜蜂传粉多样性研究

吴 帆,张 莉,周 晶,常 悦,郎一涵,沈叶萍,王 靓,李红亮

(中国计量大学 生命科学学院 浙江省生物计量及检疫检验重点实验室,浙江 杭州 310018)

在自然界中,有80%以上的开花植物需要传粉者为它们授粉,其中大部分的传粉者是昆虫[1]。作为重要的传粉昆虫之一,蜜蜂基于其独特的形态结构和生物学特性,在植物传粉方面很有优势。它不仅在维持植物生态系统稳定性和促进生物多样性方面发挥着重要的作用,而且能提高农作物和果蔬的产量和品质,具有重要的经济价值和社会效益[2,3]。

我国饲养的蜜蜂达900万群,主要有东方蜜蜂中的亚种中华蜜蜂(中蜂,Apisceranacerana)和西方蜜蜂的亚种意大利蜜蜂(意蜂,Apismelliferaligustica),其中中蜂约占三分之一,意蜂约占三分之二。中蜂是我国的本土蜜蜂,相对于意蜂,中蜂在长期进化过程中形成了适应山区环境的特性,在利用零星蜜源、采集能力和利用率上都有显著的优势[4-5]。另外,由于我国部分地区中蜂采用野生和半野生的养殖方式,其抗寒抗病等能力也较强,这不仅延长了传粉时间,也有利于山区丘陵等高寒环境下的植物授粉[5-6]。因此,调查中蜂传粉植物种类以及规律,有利于人们认知中蜂在植物生态系统中的重要作用,为后期中蜂的利用和保护提供理论依据[7]。

近些年,随着设施农业技术的推广和应用,利用昆虫授粉将有广泛的空间。设施农业在增强农业综合生产能力、提高市场竞争力和抵抗风险能力方面具有显著优势[8]。但是,设施农业种植需要相对封闭的环境,栽培空间内野生传粉昆虫的数量极少,这就导致果蔬的坐果率严重不足[9]。因此,种植者依靠外界的辅助手段来增加授粉效率,如人工蘸花和人工喷施生长调节剂等来增加坐果率[10]。然而,人工授粉方式费时费力,喷施生长调节剂又会导致果实化学药剂污染。所以,利用昆虫授粉成为理想的选择,且中蜂在设施农业授粉中已有应用[11]。但是,目前对中蜂传粉特性及季节差异性还不十分清楚,如果对中蜂传粉行为和规律深入调查研究,将有利于未来在设施农业中应用。综上所述,本研究通过深入了解蜜蜂对不同植物的传粉习性和规律,既有利于维持植物生态系统稳定和保护生物多样性,也有利于帮助农业种植者提高农作物的产量品质及经济效益,为选择蜜蜂进行作物授粉提供理论依据。

1 材料和方法

中华蜜蜂饲养于中国计量大学校园内(北纬30.32°,东经120.36°,图1),所有蜂王从育成至实验开始时均不满1年,具有强劲的产卵能力。实验中共用3箱中蜂,使用的蜂箱是标准的木质朗氏活框蜂箱。实验实施时间为2019年3-5月。

图1 样品采集范围(图示中1的位置,即中国计量大学校园)Figure 1 Sample collection area(labeled as “1”, that is the campus of China Jiliang University)

1.1 采集地植物花粉信息库的建立

采集开花植物花粉及建立蜜蜂花粉源信息库。实验期间在中国计量大学及周边(图1)观察、记录植物的开花情况,采集一定量开花植物的花蕊并收集其花粉。将花粉存放于-20 ℃下保存,利用尼康YS100光学显微镜(Nikon,Japan)和日立TM-1000电子显微镜(HITACHI,Japan)观察,并通过查找《中国木本植物花粉电镜扫描图志》和利用伯乐MyCycler PCR扩增仪(Bio-Rad,USA)扩增等技术初步建立样地植物花粉信息库。

1.2 蜂花粉样本采集及光学显微镜观察

在适合时间(天气晴朗、温湿度适中的环境条件下),每周3～4次的采集频率,每次早、中、晚各采集一次,捕捉一定量后足携带花粉的采集蜂。将蜂花粉样本在光学显微镜下观察,初步鉴定蜂花粉的形态并估算不同种类的花粉在蜂花粉中的占比,做好实验记录。其余蜂花粉样本置于-20 ℃储存,以备后期电镜观察鉴别使用。

1.3 蜂花粉样本扫描电子显微镜观察

在日立TM-1000扫描电子显微镜(HITACHI,Japan)下逐粒观察前期收集的蜂花粉,记录形态并与信息库做比较,确定每粒蜂花粉中所含花粉的植物源种类。

1.4 蜂花粉样本DNA条形码分析

对于电镜观察后无法辨别种类的蜂花粉,我们利用DNA扩增和条形码深入分析。使用生工生物工程股份有限公司(Sangon,China)的Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒,从100 mg蜂花粉样品中提取未知植物源的DNA(提取方法见说明书)。设计合适的引物序列,以上述花粉DNA为模板用MyCycler PCR扩增仪(Bio-Rad,USA)进行PCR扩增。PCR反应采用3步法扩增程序:变性、退火和延伸,各自温度和时间为:94 ℃预变性3 min;94 ℃,20 s;X ℃(根据引物设定),20 s;72 ℃,40 s;做35个循环,最后72 ℃延伸10 min。将扩增后的序列进行琼脂糖凝胶电泳,回收PCR产物送至生工进行测序,最后利用生物信息学分析,确定蜂花粉的种类。

2 结果与讨论

2.1 采集地植物花粉信息库的建立

实验期间在中国计量大学及周边地区收集开花植物花粉共37种,在采集花粉的同时拍摄植物照片,后期通过查找和比对《中国高等植物图鉴》进行鉴定,无法确定的植物再利用电子显微镜观察及查询《中国木本植物花粉电镜扫描图志》以及DNA条形码等技术分析,初步建立样地植物花粉信息库。结果表明,3—5月学校及周边开花植物包括:紫叶李[PrunusCerasiferaEhrharf.],迎春花[JasminumnudiflorumLindl.],浙江尖叶山茶[Camelliacuspidate],山樱花[Cerasusserrulate(Lindl.) G.Don ex London],垂丝海棠[MalushallianaKoehne],浙江红山茶[CamelliaChekiangoleosaHu],多花蔷薇[RosamultifloraThunb.],重瓣榆叶梅[Amygdalustrilobaf.multiplex(Bge.) Rehd.],紫荆[CercischinensisBunge],石榴[PunicagranatumLinn],玉兰[MagnoliadenudateDesr.],尖萼金丝桃[HypericumacmosepalumN.Robson],瓜叶菊[Pericallishybrida],暴马丁香[Syringareticulata(Blume) H.Hara var.amurensis(Rupr.) J.S.Pringle],石楠[Photiniaserratifolia(Desfontaines) Kalkman],鹅掌楸[Liriodendronchinense(Hemsl.) Sargent.],贴梗海棠[Chaenomelesspeciosa(Sweet) Nakai C.Lagenaria Koidz],月季[RosachinensisJacq.],荷花玉兰[MagnoliagrandifloraLinn],长叶木兰[MagnoliapaenetalaumaDandy],金橘[Fortunellamargarita(Lour.) Swingle],三色堇[ViolatricolorL.],杏花[Armeniacavulgaris],结香[Edgeworthiachrysantha],金盏花[CalendulaofficinalisL.],木绣球[ViburnummacrocephalumFort.],琼花[ViburnummacrocephalumFort.f.keteleeri(Carr.) Rehd.],杜鹃[RhododendronsimsiiPlanch.],火棘[Pyracanthafortuneana(Maxim.) Li],香泡[Citrusmedica],香樟[Cinnamomumcamphora(L.) Presl.],七姊妹[RosamultifloraThunb.var.carneaThory],棕榈[Trachycarpusfortune(Hook. f.) H.Wendl.],女贞[Ligustrumlucidum],向日葵[HelianthusannuusL.],碧冬茄[Petuniahybrida],金鸡菊[Coreopsisdrummondii]。

其中大部分为多年生开花植物,如紫叶李、玉兰、鹅掌楸等乔木和灌木;少部分为学校移栽的一年至两年生的观赏性植物,如三色堇、碧冬茄、金盏花等草本植物。

2.2 蜂花粉收集及显微镜观察

在蜂箱巢门口等待,抓取足部带花粉的采集蜂,收集花粉。期间共收集23次,平均每次约12粒,共约300粒花粉。观察结果显示,每天收集的蜂花粉约有3～4种花粉植物源(不同日期有重复收集现象),利用光学显微镜(40×)下观察,初步辨别出不同形态的花粉(图2),共收集了27种蜂花粉。

图2 光学显微镜下部分蜂花粉Figure 2 Pictures of bee pollens under an optical microscope

对普通光学显微镜无法确定植物源的蜂花粉,进一步利用电子显微镜观察,将拍摄的蜂花粉电镜照片与《中国木本植物花粉电镜扫描图志》及样地植物花粉电镜图进行对比,根据花粉形状、大小以及花粉壁的结构和纹饰,最终鉴定出21种植物花粉(图3)。

蜂花粉的植物源依次为:1—紫叶李;2—迎春花;3—浙江尖叶山茶;4—山樱花;5—垂丝海棠;6—浙江红山茶;7—多花蔷薇;8—重瓣榆叶梅;9—紫荆;10—石榴;11—玉兰;12—尖萼金丝桃;13—瓜叶菊;14—暴马丁香;15—石楠;16—鹅掌楸;17—贴梗海棠;18—月季;19—荷花玉兰;20—长叶木兰;21—金橘

2.3 DNA条形码技术鉴定蜂花粉

经过电子显微镜观察分析后,还有6种蜂花粉未能明确辨别出其花粉源植物的种类,最后通过DNA条形码进行鉴定。使用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒,对这些蜂花粉进行DNA提取,结果表明可以成功提取蜂花粉DNA,NanoDrop 2000测定提取DNA质量浓度均超过200 ng/μL。PCR扩增使用的引物是由生工公司合成,引物序列如表1。

表1 用于DNA条形码分析的引物序列

本实验选择两组引物用于DNA条形码分析,第一组使用TPtrnH-F、TPpsbA-R分别作为正反引物,第二组使用rbcL-1F、rbcL-724R作为正反引物,以上述蜂花粉提取的DNA为模板进行PCR扩增。对扩增后的样品进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结果照片如图4。

图4 DNA条形码基因扩增电泳图Figure 4 Gene amplification result of DNA barcode analysis

根据电泳结果可知,使用rbcL-1F、rbcL-724R作为正反引物进行PCR扩增的效果较好。琼脂糖凝胶块,用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目的条带,送至公司测序。但是,由于送检样品DNA浓度过低,未能测出目的条带序列。

2.4 数据统计与分析

根据上述蜂花粉植物源鉴定结果,绘制了蜂花粉植物源分布情况。如图5所示,2019年3月上旬,由于温度过低(只有5～12 ℃),学校校园内及周围没有发现中蜂采集花粉的行为。箱内检查发现还有少量蜂粮,说明蜂群正常越冬。3月中下旬,开始观察到中蜂采粉回巢的现象。该时间段内中蜂采集周期最长的为迎春花和浙江尖叶山茶的花粉,整个3月下旬都有采集。除此之外,中蜂对紫叶李、山樱花、浙江红山茶花粉的采集时间也较长,都有一周左右得时间。在3月份,也观察到中蜂采集蚕丝海棠、多花蔷薇、重瓣榆叶梅和紫荆的花粉,但周期很短,只在月底观察到一次。

图5 3-5月份中蜂采集蜂花粉植物源分布情况图Figure 5 Plant source distribution map of bee pollen collected by Apis cerana cerana from March to May

4月份,中蜂继续采集浙江红山茶、浙江尖叶山茶、山樱花和紫荆花粉,其中浙江红山茶整个4月中蜂都有采集,是实验期间内采集周期最长的植物源,约有40 d。相对于3月份,4月份中蜂采集的新花粉源有鹅掌楸、贴梗海棠、月季、荷花玉兰、长叶木兰和金桔,而且都集中在4月下旬,其中鹅掌楸和月季的采集周期较长。此外,中蜂在4月份的采集行为要比3月份更为活跃,这可能与蜂王产卵能力增强有关。因为幼虫发育需要工蜂饲喂蜂王浆,而蜂王浆蛋白的合成来源主要来自于花粉中的蛋白质[12]。研究表明,幼虫哺育能力强的蜂群其花粉采集能力也更好[13]。

相对于3、4月份,5月份中蜂的采集活动明显减少,甚至下旬没有观察到采集活动。调查发现,一方面由于学校及周边开花植物源减少,另一方面推测可能由于采集花朵花期较短、花朵闭合蜜蜂难以采集。但是,中蜂采集到了尖萼金丝桃、瓜叶菊、暴马丁香和石楠等几种新植物源的花粉,其中采集尖萼金丝桃是在5月初,采集瓜叶菊、暴马丁香和石楠是在5月中上旬。

统计蜜蜂所携花粉植物源所属生物学分类科别(见图6)可知,采集数量排在前五的科分别是木兰科(29%)、蔷薇科(27%)、山茶科(10%)、豆科(8%)和木犀科(7%)。中蜂采集的花粉中属于木兰科的植物有鹅掌楸、荷花玉兰、长叶木兰、玉兰;属于蔷薇科的植物有紫叶李、山樱花、垂丝海棠、多花蔷薇、榆叶梅、贴梗海棠、月季、石楠;属于山茶科的植物有浙江尖叶山茶、浙江红山茶;属于豆科的植物有紫荆;属于木犀科的植物有迎春花、暴马丁香。

图6 中蜂3-5月采集的蜂花粉植物源科分布图Figure 6 Family distribution map of bee pollen collected by Apis cerana cerana from March to May

总体而言,中蜂可为多种开花植物传粉,这对维持植物生存和生态稳定具有重要意义。结合校园内及周边开花植物源情况进一步分析发现:第一,中蜂采集不同花粉的周期与植物源的开花时间具有高度一致性;第二,中蜂对一年至两年生的观赏性植物采集很少,可能是迁移栽种时间短,中蜂还未适应,故不喜采集。因此,我们认为,在长期的生态衍化进程中,中蜂已经对栖息地植物形成了良好的适应性,可根据花期动态演化而调整采集行为;不过对于同花期的植物源来说,中蜂采集行为仍然具有偏好性,这与植物源的花型、花期和蜜粉含量等有密切关系。

通过蜜蜂携带花粉可以初步判定传粉植物的种类及传粉多样性,然而这种判断具有一定的局限性。比如某些开花植物蜜多粉少,而采粉蜂不去采集这种蜜粉源,但采蜜蜂在采集此种蜜粉源植物时即使后足不携带花粉团,实际上也产生了传粉行为。因此本研究只适用于对蜜蜂粉源充足的植物。实际上本研究涉及的37种植物确实均为多粉源植物,即如果采集蜂对该植物有采集行为,就能实现携粉归巢。实验中未见多蜜而少粉的植物,故不考虑蜜蜂采蜜时的间接授粉的情况。

3 结 论

综上所述,浙江省杭州市钱塘新区中国计量大学校园内及周边地区3-5月份开花植物约有37种,其中中华蜜蜂可以传粉的植物达到27种,占总数的73%,说明中蜂的传粉植物种类具有广谱性。在长期共进化过程中,中蜂的传粉行为已经适应了相应开花植物的花期,这种适应性对于中蜂和植物双方维系都有益处,也是地理生态长期共同进化的结果。不过,对于同花期的开花植物源,中蜂传粉仍具有一定的选择性和偏好性,如偏好为花朵形态较大且易采集的蔷薇科、木兰科等植物,而对形态较小且闭合的花朵采集能力相对较低。本研究有助于我们进一步了解中蜂传粉习性和规律,也给中蜂养殖和农作物种植有机结合提供了科学基础。此外,在设施农业种植中合理引入中蜂授粉以及不同植物间套种植,可以提高授粉效率进而提高农作物产量和品质。