扶正祛毒方抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖及对PI3K/Akt信号通路和血管内皮生长因子C、血管内皮细胞生长因子受体3表达的影响Δ

时 华，杨 中，李 颖

(1.北京中医医院延庆医院普外科，北京 延庆 102100； 2.首都医科大学附属北京中医医院肿瘤科，北京 东城 100010)

乳腺癌的发病率在女性恶性肿瘤中居首位，严重威胁女性的健康与生命安全[1]。虽然现代恶性肿瘤治疗方法在不断更新进步，患者总体生存率有所提高，但目前尚无完全治愈的方法，患者复发率仍较高，且晚期乳腺癌的治疗仍是临床治疗的棘手问题。多种中药被证实具有抗恶性肿瘤效果，且中医辅助疗法在多种肿瘤综合治疗中发挥了重要作用[2]。有研究结果显示，PI3K/Akt信号通路在乳腺癌细胞生长、增殖和转移过程中发挥重要的调节作用[3]。血管内皮生长因子(VEGF)C是VEGF家族中最强的促淋巴生成因子，其在肿瘤中高表达，与肿瘤细胞的淋巴管生成和扩大密切相关[4]。本研究基于PI3K/AKT信号通路，通过扶正祛毒方对人乳腺癌MCF-7细胞进行干预，探讨中药对乳腺癌细胞增殖及对VEGF-C、VEGFR-3表达和PI3K/Akt信号通路的影响，现报告如下。

1 材料

1.1 细胞株

人乳腺癌细胞株MCF-7由上海机纯实业有限公司提供。

1.2 药品与试剂

扶正祛毒方组方如下：黄芪25 g，黄精15 g，白术15 g，茯苓15 g，白花蛇舌草10 g，莪术10 g，苦参10 g，浙贝母10 g，半枝莲10 g，天冬10 g。均由北京中医医院延庆医院中药房提供，按照传统方法煎制成汤剂，浓缩至100 ml，每1 ml含生药3.1 g。RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)购自上海语纯生物科技有限公司；胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MMT)购自德国WAK公司；Trizol试剂、逆转录试剂盒及蛋白提取试剂盒购自美国Sigma公司；人血管生长因子VEGF-C、VEGFR-3聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测试剂盒购自上海沪震生物科技有限公司。兔抗人磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)购自美国Thermo公司。

1.3 仪器

艾本德6孔细胞培养板(德国Eppendorf公司)；SW-CJ-1FD型细胞超净工作台(苏州净化设备有限公司)；Mini-PROTEANTetra电泳仪(美国Bio-RAD公司)；ChemiDoc XRS+型凝胶成像系统(美国Bio-RAD公司)；SPECTROstar Omega型全自动多功能酶标仪(德国BMG公司)；HH.CP-T型CO2培养箱(杭州川一实验仪器有限公司)；IX73型倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)；DU-650型紫外分光光度计(美国Beckman公司)；StepOne TM型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

2 方法

2.1 细胞培养

使用完全培养基(含有10%FBS的RPMI-1640培养基)在37 ℃、5%CO2、完全饱和湿度培养箱中培养人乳腺癌细胞株MCF-7；待细胞贴壁后更换培养液，细胞覆盖培养皿皿底80%左右时采用胰蛋白酶消化传代，时间约1～2 min，比例为1∶2；细胞传代至对数生长周期后用于后续实验[5]。

2.2 MMT法检测益气补肾扶正方对细胞生长抑制的影响

收集对数生长周期的细胞，以3×104个/孔的密度将其接种于96孔培养板中，每孔100 μl，5%CO2、37 ℃完全饱和湿度环境下孵育24 h。细胞贴壁后加入浓度梯度(5、10及20 μmol/L)扶正祛毒方培养基，终体积为200 μl。培养24 h后每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，继续培养4 h后终止培养，加入DMSO溶液150 μl，低速震荡10 min，待紫色结晶充分溶解后使用酶标仪检测各孔490 nm处的吸光度(OD)，每组设6个复孔，重复3次取平均值,计算增殖抑制率[6]。

2.3 逆转录PCR(RT-PCR)法检测VEGF-C、VEGFR-3 mRNA水平

细胞培养和处理同“2.1”和“2.2”项，严格按照试剂盒要求提取总RNA，进行逆转录反应(逆转录体系20 μl)，再行PCR扩增。反应条件：95 ℃、10 min，95 ℃、20 s，60 ℃、20 s，70 ℃、40 s，35个循环。GADPH为内参，检测相对表达量。基因引物序列：VEGF-C上游5′-CAGATGAATT-ACTCGGTTAA-3′，下游5′-GGACACACTGA-AACTCCAATC-3′；VEGFR-3上游5′-CAGCAGCCAATA-TCTCACAATAAGCA-3′，下游5′-CATGC GGTGTTG-AGCAATTGCG-3′；GADPH上游5′-TC-CCATCACC ATATTCCAG-3′，下游5′-AGGAGT-GGGTGTCGCTG-3′。读取各孔VEGF-C、VEGFR-3和GADPH CT值，用比较阈值法(ΔCT值法)进行统计分析。重复3次，取ΔCT平均值[7]。

2.4 蛋白质印迹法检测PI3K、AKT蛋白表达水平

按试剂盒说明书要求配制蛋白裂解液；以2 mg/ml的BSA原液制备蛋白标准梯度浓度，采用BCA法检测蛋白浓度，酶标仪测定OD(595 nm)，以OD为纵坐标，以蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线，计算蛋白浓度；20 μg/泳道蛋白上样，1.5%琼脂糖凝胶，80 V/20 min，120 V/70 min电泳90 min；恒流，250 mA，90 min转膜；常温、5%BSA封闭1 h；裁剪条带都加入一抗，4 ℃过夜；次日取条带采用TBST清洗3次，1次5 min；加入二抗，避光常温孕育1 h；再次TBST清洗4次，1次5 min。于暗室内以荧光曝光机进行曝光，多功能成像和定量分析系统进行条带灰度分析，采用Image J软件进行后期处理[8]。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 扶正祛毒方对人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制率的影响

扶正祛毒方低剂、中及高剂量组细胞增殖抑制率明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示扶正祛毒方对乳腺癌细胞增殖具有较好的抑制效果，且随着剂量的增加抑制效果越明显，见表1。

表1 扶正祛毒方对人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制率的影响Tab 1 Effect of Fuzheng Qudu prescription on the inhibition rate of cell proliferation of human breast cancer

3.2 扶正祛毒方对人乳腺癌MCF-7细胞VEGF-C、VEGFR-3 mRNA表达的影响

扶正祛毒方低剂、中及高剂量组细胞VEGF-C、VEGFR-3 mRNA水平明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示扶正祛毒方能够下调VEGF-C、VEGFR-3基因水平，且随着剂量的增加下调幅度越大，见表2。

表2 扶正祛毒方对人乳腺癌MCF-7细胞VEGF-C、VEGFR-3 mRNA表达的影响Tab 2 Effect of Fuzheng Qudu prescription on the mRNA expression of VEGF-C and VEGFR-3 in human breast

3.3 扶正祛毒方对人乳腺癌MCF-7细胞PI3K、Akt蛋白相对表达的影响

扶正祛毒方低剂、中及高剂量组细胞PI3K、Akt蛋白相对表达水平明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，且呈剂量依赖性，剂量越大下降幅度越明显，见表3、图1。

表3 扶正祛毒方对人乳腺癌MCF-7细胞PI3K、Akt蛋白相对表达的影响Tab 3 Effect of Fuzheng Qudu prescription on PI3K and Akt protein relative expression of human breast cancer

图1 PI3K、Akt蛋白表达Fig 1 Expression of PI3K and Akt protein

4 讨论

乳腺癌对患者的身体健康和生活水平造成了严重影响，且发病逐渐呈现年轻化的趋势[9]。乳腺癌早期发病具有隐匿性，加上目前女性常面临家庭和工作的双重压力，精神长期处于紧张状态，忽视了乳腺癌的早期症状，发现时多已经处于中晚期，即便经过成功的治疗，发生复发和转移的风险仍很大[10]。

近年来，中医药治疗乳腺癌在临床治疗和基础研究等方面均取得长足的发展。在中医理论中，肿瘤形成的先决条件是机体正气亏虚[11]。肾中精气盛衰和运化在很大程度上决定了乳房功能是否能够正常运行[12]。正气亏虚则癌毒伤正，无力祛邪外出，外侵之邪积聚于人体脏腑中，痰瘀内阻，毒瘀互结，日久成瘤[13-14]。肿瘤的生长不断侵蚀人体正气，久病多虚，尤其是中晚期患者；加上手术、放疗和化疗等现代治疗手段均会对气血、脏腑造成损伤，两者恶性循环，大大增加了转移的风险[15]。癌毒是一种集合“痰、瘀、湿、热”共性的产物，且相互之间能够联系、转化[16]。癌毒作为复合致病因素，导致肿瘤生长并长期对机体造成损害，是肿瘤的发病之根。癌毒形成后，气机受阻，津液运行不畅，聚而成痰，血阻成瘀，痰瘀搏结，形成肿块[17]。

中医治疗乳腺癌各阶段皆有其特点。早期正虚尚未完全显露，治疗以祛邪为主，扶正为辅，祛邪而不伤正；中期正气亏虚逐渐显露，邪气已成气候，正邪相倚而立，当以扶正、祛邪并而治之；晚期正气遭邪气不断侵蚀，正邪矛盾尖锐，治疗当以扶正为主，祛邪为辅[18]。本研究秉承“时时扶正，适时祛邪”的原则，拟用自拟扶正祛毒方治疗乳腺癌。方中，黄芪补气固表，适用于气虚乏力等症状；黄精补气、养阴、益肾，白术健脾益气，茯苓健脾宁心，白花蛇舌草清热解毒，莪术行气止痛，半枝莲清热解毒、化瘀利尿，苦参清热凉血、杀虫解毒，浙贝母清热化痰、散结解毒，天冬养阴润燥、清肺生津。黄芪、白术、茯苓和黄精扶正之余兼有抑癌、抗癌之功，白花蛇舌草、莪术和半枝莲在抗癌的同时亦能扶正。诸药合用，扶正固本治本，兼顾祛毒散结、活血化瘀，标本兼治，既能提高患者免疫功能，还能抑制乳腺癌细胞生长，发挥抗恶性肿瘤作用。本研究结果显示，扶正祛毒方低剂、中及高剂量组细胞增殖抑制率明显高于对照组，提示扶正祛毒方对乳腺癌细胞增殖具有较好的抑制效果，且随着剂量的增加抑制效果更明显。

PI3K/Akt是细胞内重要的信号通路，在各种肿瘤细胞中异常活跃[19]。PI3K能够被上游上皮生长因子家族等活化，导致Akt磷酸化。作为PI3K重要的下游分子，Akt在PI3K/Akt信号通路中具有枢纽性作用。活化后的Akt生物学活性多样，可通过一系列磷酸化作用促进肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和转移，抑制肿瘤细胞凋亡，耐受放化疗等多种治疗[20]。磷酸化的Akt可以进一步活化下游的mTOR1，促进肿瘤细胞的糖代谢。PI3K/Akt信号通路磷酸化后还能抑制抑癌基因PTEN，导致PIP3脱磷酸化机制失活，产生更多的PIP3，加速肿瘤细胞的增殖和转移[21]。PI3K和其下游分子所转导的抗凋亡信号已经成为药物研究领域的焦点。近年来的研究结果表明，PI3K/Ak信号通路在诸多恶性肿瘤中过度活化。李慧等[22]的研究结果显示，PI3K、Akt mRNA低表达患者的总生存时间长于高表达患者，发现PI3K/Akt信号通路过度表达与患者生存时间和耐药情况相关。本研究中，蛋白质印迹法检测结果显示，扶正祛毒方低剂、中及高剂量组细胞PI3K、Akt蛋白表达水平明显低于对照组，随着浓度的提高蛋白表达逐渐降低，提示扶正祛毒方可能通过抑制PI3K、Akt蛋白磷酸化，使PI3K/AKT信号通路转导受阻，从而发挥抗恶性肿瘤作用。

VEGF-C与血管生成相关，是判断微淋巴管生成的指标，是最先被发现，亦是目前为止最强的促淋巴生成因子。VEGF-C作用于VEGFR-2和VEGFR-3，其中，VEGF-C/VEGFR-3在恶性肿瘤组织新生血管和新生淋巴管的形成过程中发挥作用，且在不同的信号通路中调控不同的细胞功能[23]。VEGF-C与其受体VEGFR-3结合后促进淋巴管内皮细胞的增殖和迁移，诱导新的淋巴管生成。新生的淋巴管连续的基底膜缺失导致肿瘤细胞易通过内皮细胞间的缝隙进入淋巴管，进而转移至局部淋巴结形成转移灶。同时，VEGF-C还能引起肿瘤外周淋巴管扩张和直径增大，增加肿瘤细胞与淋巴管的接触面积，提高淋巴管转移效率。刘新兰等[24]的研究结果发现，VEGF-C、VEGFR-3在乳腺癌组织中存在高表达，且与恶性肿瘤的发生、侵袭和转移有关。谢晓斌等[25]的研究结果显示，VEGF-C/VEGFR-3对乳腺癌细胞的增殖具有促进作用，与乳腺癌组织的淋巴管生成及淋巴结转移密切相关。理论上，阻断VEGF-C/VEGFR-3信号转导途径能够抑制乳腺癌细胞增殖及淋巴转移。体内研究结果发现，采用RNA干扰对VEGF-C的转录和翻译进行抑制后，VEGF-C/VEGFR-3被有效切断，淋巴管内皮细胞的增殖明显减少，证实下调VEGF-C的表达能够有效抑制乳腺癌淋巴管生成和淋巴转移。本研究中，RT-PCR法检测结果显示，扶正祛毒方低剂、中及高剂量组细胞VEGF-C、VEGFR-3 mRNA水平明显低于对照组；MTT法检测结果显示，扶正祛毒方低剂、中及高剂量组细胞增殖抑制率明显高于对照组，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，提示扶正祛毒方可能通过下调VEGF-C、VEGFR-3基因表达，抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖。

综上所述，扶正祛毒方能够抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖，其机制可能与阻断PI3K/Akt信号通路，下调VEGF-C、VEGFR-3基因表达有关。