高效液相色谱法和紫外-可见分光光度法测定竹叶花椒中2种主要成分的含量*

齐景梁，高必兴，，周 娟，苟 琰，，耿 昭，姜卫东△，陈 茜

（1.四川省食品药品检验检测院·国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，四川 成都 611731；2.成都中医药大学，四川 成都 611137）

竹叶花椒来源于芸香科花椒属植物竹叶花椒Zanthoxylum armatumDC.的干燥成熟果皮，主要分布于我国西南、华南、华东和华中地区［1-2］，四川地区常称其为“藤椒”，具有较长的药用历史，常作民间药用或在部分地区作花椒用。竹叶花椒在《本草纲目》《证类本草》《植物名实图考》等古代本草中均有记载［3-4］，具有温中止痛、杀虫止痒之功效，用于治疗脘腹冷痛、呕吐泄泻、虫积腹痛，外治湿疹瘙痒［5-6］。现代研究表明，竹叶花椒主要含有挥发油、酰胺类物质、生物碱、黄酮等成分，具有抑菌、抗炎、杀虫、麻醉、镇痛、调节糖脂代谢紊乱、保护胃肠道等功效［7-10］。其中，酰胺类物质是竹叶花椒产生麻味的物质基础，又以山椒素类物质如羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素为代表［11-12］，具有广泛的生物活性［13-15］。目前，部分省市的地方中药材标准如2009年版《湖南省中药材标准》、1999年版《广西中药材标准》、2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》等均收载有竹叶花椒，但由于制订时间较早，标准较简单，缺乏含量控制项，不能很好地控制其质量［16-18］。本研究中，分别采用高效液相色谱法和紫外-可见分光光度法测定竹叶花椒中羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的含量，为完善竹叶花椒药材质量标准提供科学依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

XP205型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度为0.01mg）；e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；TU-1901型紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；HU-20500D型超声波清洗仪（天津市恒奥科技发展有限公司，功率为400W，频率为40kHz）。

1.2 试药

羟基-α-山椒素（批号为RP181113），羟基-β-山椒素（批号为RP180508），均购自成都麦德生科技有限公司，规格为每支20mg，纯度≥98.00%；乙腈（赛默飞世尔科技有限公司，色谱纯）；甲醇（成都科隆化学品有限公司，分析纯）；水为超纯水；20批竹叶花椒样品产地见表1，经四川省食品药品检验检测院黎跃成主任中药师鉴定为正品。

表1 样品产地信息Tab.1 Origin information of sam ples

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱法

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Kromasil100-5 C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（40∶60，V/V）；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：270 nm。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，按拟订色谱条件进样测定，目标色谱峰与邻近峰均达到完全分离（分离度大于1.5）。羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素理论板数均在20 000以上。色谱图见图1。

2.1.2 溶液制备

对照品溶液：分别精密称取羟基-α-山椒素对照品和羟基-β-山椒素对照品适量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1mL含羟基-α-山椒素79.11μg、羟基-β-山椒素9.471μg的溶液，即得。

供试品溶液：取供试品粉末（过3号筛）约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定质量，超声处理30min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，置25mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chrom atogram s

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：精密量取2.1.2项下对照品溶液10，20，50μL，稀释2倍、10倍后的对照品溶液各10μL分别注入液相色谱仪，测定峰面积，并以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标进行线性回归，得回归方程，羟基-α-山椒素为Y1=8 397.76X1+135 685.15（r1=1.00），羟基-β-山椒素为Y2=8 893.16X2-18 858.23（r2=1.00）。羟基-α-山椒素与羟基-β-山椒素进样量分别在0.079 11～3.955 50μg和0.009 5～0.473 6μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.1.2项下对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积。结果羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素峰面积的RSD分别为0.42%和0.67%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一样品（编号为HY-4），平行制备6份供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素含量的RSD分别为0.50%和0.65%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一样品（编号为HY-4），依法制备供试品溶液，室温下保存，分别于0，2，4，8，12 h时测定。结果羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素含量的RSD分别为0.74%和1.13%（n=6），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

加样回收试验：取6份已知含量的样品（编号为HY-4）粉末（过3号筛）0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入与样品中的量相当的羟基-α-山椒素对照品和

羟基-β-山椒素对照品，按2.1.2项方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果见表2。

耐用性试验：取同一样品（编号为HY-4），分别考察Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Thermo HypersilGOLD C18柱（250mm×4.6mm，5μm），Waters Xbridge C18柱（250mm×4.6mm，5μm）。结果不同色谱柱测得羟基-α-山椒素含量的RSD为0.25%，羟基-β-山椒素含量的RSD为1.04%，表明方法耐用性良好。

2.1.4 样品含量测定

取20批样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果见表3。

表2 高效液相色谱法加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of recovery test by HPLC（n=6）

表3 高效液相色谱法含量测定结果（%，n=3）Tab.3 Resu lts of content determ ination by HPLC（%，n=3）

2.2 紫外-可见分光光度法

2.2.1 检测波长选择

在紫外-可见分光光度计下分别对羟基-α-山椒素对照品溶液、供试品溶液进行光谱扫描。结果，供试品溶液与羟基-α-山椒素对照品溶液吸收光谱一致，且均于270 nm波长处有最大吸收，故选择270 nm作为检测波长。

2.2.2 溶液制备

对照品溶液：精密称取羟基-α-山椒素对照品适量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1mL含羟基-α-山椒素15.82μg的溶液，即得。

供试品溶液：取供试品粉末（过3号筛）约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定质量，超声处理30min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再精密量取0.3mL，置10mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 方法学考察

线性关系考察：精密量取对照品溶液0.5，1，2，3，5mL，置10mL容量瓶中，分别加甲醇至刻度，摇匀，以甲醇为空白对照，照紫外-可见分光光度法（2015年版《中国药典（四部）》通则0401），于270 nm波长处测定吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=0.166X-0.003，r=1.00。结果羟基-α-山椒素质量浓度在0.7910～7.9100μg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

精密度试验：精密吸取2.2.2项下对照品溶液2mL，置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，以甲醇为空白对照，于270 nm波长处测定吸收度，连续测定6次。结果的RSD为0.23%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一样品（编号为HY-4），平行制备6份供试品溶液，依法进样测定。结果6份样品含量的RSD为0.29%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一样品（编号为HY-4），依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，12 h时进样测定。结果的RSD为0.45%（n=6），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

加样回收试验：取6份已知含量的样品（编号为HY-4）粉末（过3号筛）0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入羟基-α-山椒素对照品溶液（每1mL含羟基-α-山椒素0.196 0mg）25mL，再精密加入甲醇25mL，称定质量，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，依法进样测定，计算回收率。结果见表4。

表4 紫外-可见分光光度法加样回收试验结果（n=6）Tab.4 Results of recovery test by ultraviolet-visible spectrophotometry（n=6）

2.2.4 样品含量测定

取20批样品，依法制备供试品溶液，按拟订方法进样测定。结果见表5。

表5 紫外-可见分光光度法含量测定结果（%，n=3）Tab.5 Results of content determ ination by ultraviolet-visible spectrophotometry（%，n=3）

3 讨论

本研究中参考花椒及作为食品的藤椒、藤椒油含量测定的相关研究［19-22］，建立了基于高效液相色谱法和紫外-可见分光光度法的竹叶花椒含量的测定方法。羟基-α-山椒素在特定条件下会转化为同分异构体羟基-β-山椒素［23］，本研究中建立的高效液相色谱法同时测定羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素，以二者的总含量进行评价，可避免因同分异构体转化而产生的误差。另外，酰胺类物质是竹叶花椒中的一类链状不饱和脂肪酸成分，除羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素外，竹叶花椒中还存在其他结构类似的酰胺类物质［24］，故建立了紫外-可见分光光度法测定酰胺类物质总量的方法。曾考察供试品溶液的提取方法（超声提取、回流提取）、提取溶剂（水、乙醇、甲醇）及提取时间（10，30，45，60min）。最终，确定甲醇超声提取30min作为供试品溶液的制备方法。高效液相色谱法和紫外-可见分光光度法含量测定方法中的供试品前处理相同，制备同一份供试品溶液可供2种方法使用，符合检验经济学的要求。

本研究主要针对竹叶花椒中的麻味物质进行质量控制，但竹叶花椒中还含有挥发性香味物质。采用气相色谱-质谱联用方法分析鲜竹叶花椒果实中的挥发性物质，含量最高成分的是芳樟醇、柠檬烯、桉树脑等［25-27］。对于挥发性物质可否作为指标成分对竹叶花椒药材进行质量控制及如何控制，需进一步开展系统研究。