基于网络药理学的葡萄籽油抗癌和抗肿瘤功能成分及机制研究

张丽明，马雅鸽，张 希，赵声兰✉，陈朝银，梁仲雄

（1. 云南中医药大学，云南 昆明 650500；2. 云南经济管理学院，云南 昆明650106；3. 云南成满生物科技有限公司，云南 大理 671600）

癌症是严重危害人类身体健康的常见疾病。据全球肿瘤流行病统计数据GLOBOCAN 2018估计，世界癌症新发病例约有 1 808万例，而死亡病例约 956万例，其中中国分别约占 23.7%和30%。在地域发病情况方面，亚洲的癌症死亡数占全球 57.3%，且预后差、死亡率高的癌症类型在这些地区发生率较高[1]。癌症的发病形势日益严峻，使得肿瘤预防和治疗的社会压力和医疗压力与日俱增。现代医学对癌症的治疗主要以手术、化疗、放疗及靶向药物为主，由于其较大的副作用及肿瘤自身的消耗性，患者正气虚弱、气血亏损，治疗效果不尽人意，甚至出现“一边治疗，一边转移”的现象[2]。近几年来，中药由于其药源广泛，副作用小等特点备受关注，成为抗肿瘤药物研究的热点[3]。

葡萄籽是葡萄科葡萄属植物葡萄（Vitis viniferaL.）的种子。葡萄籽油是葡萄籽活性部位之一，含有丰富的亚油酸[4]、维生素E[5-6]、植物甾醇[7-8]、多酚[9-10]、角鲨烯[11]和类胡萝卜素[12]等活性成分，具有延缓衰老、抑制肥胖、抗癌、抗肿瘤、抗炎、降血脂等生物功能[13]。网络药理学主要通过文献挖掘等方法构建生物信息网络，通过分析网络拓扑结构以及选取特定信号节点进行药物作用多靶点预测，其研究思路与中医药整体观念相一致，可应用于解决中药及复方研究中多成分、多靶点、协同作用特点带来的难题[14]。本研究基于网络药理学的方法挖掘葡萄籽油抗癌和抗肿瘤的活性成分及作用靶点，揭示其作用机制。

1 材料与方法

1.1 葡萄籽油活性成分及靶点的收集

通过查阅文献收集葡萄籽油的活性成分及利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）获得其口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、类药性（drug-likeness，DL）和小肠上皮细胞渗透率（Caco-2 permeability）值及各活性成分对应靶点，汇集靶点，并通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）将药物靶点的蛋白名称转换成GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）的基因名称。

1.2 癌症/肿瘤相关靶点的搜集

从在线孟德尔人类遗传数据库（OMIM，https://www.omim.org/）和人类基因数据库（Gene-Cards，https://www.genecards.org/）中收集与关键词“cancer”和“tumor”相关的靶点，整理获得癌症和肿瘤相关靶点。

1.3 活性成分-疾病靶点网络构建及可视化分析

使用Venn在线软件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）将活性成分靶点-癌症和肿瘤相关靶点取交集，获得葡萄籽油的潜在抗癌和抗肿瘤靶点。将交集靶点导入 Cytoscape3.7.2软件[15]，建立药物-活性成分-靶点-疾病网络图。图中节点（node）代表葡萄籽油、活性成分、靶点、疾病，边（edge）分别代表活性成分和靶点或靶点和疾病的交互作用。

1.4 蛋白互作网络（PPI网络）的构建

将筛选得到的潜在抗癌和抗肿瘤靶点导入String[16]（https://string-db.org， ver 11.0）在线平台数据库，以研究靶蛋白相互作用，设置物种为“人类”，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI网络）。在PPI图中，每一个实心圆圈代表一个基因，圆圈的中间显示蛋白质的结构，而圆圈由不同颜色的线条连接。每一线条代表蛋白质与蛋白质之间的生物学过程，包括基因表达调控、信号转导、细胞迁移等。

1.5 GO 功能和KEGG通路富集分析

采用DAVID6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov/），对葡萄籽油潜在抗癌和抗肿瘤靶点进行GO功能分析，以了解靶点的生物学过程，KEGG通路分析研究药物靶点主要信号通路，DAVID平台列表与背景均设置为“Homo sapiens”（人类），GO富集分析选择生物过程（biological process）、分子功能（molecular function）和细胞组成（cellular component）3个模块，通路分析选择KEGG。

2 结果

2.1 葡萄籽油活性成分及靶点的筛选

通过已有文献报道[17-20]，筛选得到葡萄籽油主要活性成分15种，为脂肪酸及其油脂伴随物。利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）检索到葡萄籽油主要活性成分除角鲨烯外均有对应靶点，总计 366个，删除重复项，共获得 236个活性成分靶点。葡萄籽油主要活性成分信息见表1。

2.2 葡萄籽油活性成分抗癌和抗肿瘤靶点收集

在两个疾病数据库中输入关键词“cancer”和“tumor”进行疾病靶点搜索，GeneCards数据库以 score≥30进行筛选，得到 667个，OMIM数据库得到24个，合并获得686个癌症和肿瘤相关靶点。利用Venn在线软件将葡萄籽油活性成分对应的209个药物靶点（删除未找到基因名称的靶点）与癌症及肿瘤相关的686个疾病靶点取交集，通过Venn图（如图1）的形式得到93个葡萄籽油潜在抗癌和抗肿瘤靶点（见表2）。

图1 药物靶点与疾病靶点关系图Fig.1 The relationship between drug targets and disease targets

表2 葡萄籽油潜在抗癌和抗肿瘤靶点信息Table 2 Information on potential anti-cancer and anti-tumor targets of grape seed oil

续表2

2.3 葡萄籽油活性成分-抗癌和抗肿瘤靶点网络构建

利用 Cytoscape 3.7.2软件建立药物-活性成分-靶点-疾病的可视化网络图（图 2），共有108个节点、390条边，其中红色节点代表葡萄籽油，13个紫色节点代表葡萄籽油的活性成分，93个蓝色节点代表癌症和肿瘤靶点，黄色节点代表癌症和肿瘤，390条边代表节点之间的相互作用。该网络中化合物的平均度值为22.77，由高到低依次为 Trans-resveratrol（反式白藜芦醇）（degree=158）、ursolic acid（熊果酸）（degree=68）、(-)-epicatechin（表儿茶素）（degree=24）、palmitic acid（棕榈酸）（degree=14）、(+)-catechin（儿茶素）（degree=6）、Stigmasterol（豆甾醇）（degree=6）、Vitamin E（维生素 E）（degree=4）、stearic acid（硬脂酸）（degree=4）、oleic acid（油酸）（degree=4）、brassicasterol（菜籽甾醇）（degree=2）、Erucic acid（芥酸）（degree=2）、Linolenic acid（亚麻酸）（degree=2）、Linoleic acid（亚油酸）（degree=2），其中反式白藜芦醇、熊果酸、表儿茶素、棕榈酸等可能是主要抗癌和抗肿瘤物质基础。由图可知，Trans-resveratrol（反式白藜芦醇）作用于PTGS2、BCL2、IL10、TNF、PTEN、PLAU、CAT、AKT1、JUN、IL6、CASP3、CCL2、IL1A、RELA 等 79个靶点，ursolic acid（熊果酸）作用于PTGS2、BCL2、TNF、PLAU、JUN、IL6、CASP3、CREB1、RELA、STAT3等34个靶点，(-)-epicatechin（表儿茶素）作用于 PTGS2、TNF、PLAU、ESR1、AKT1、JUN、IL6、CASP3、CREB1、CCL2、IL2、IL1A这12个靶点，palmitic acid（棕榈酸）作用于 PTGS2、CTSD、BCL2、IL10、TNF、COL1A1、PTEN这7个靶点；靶点PTGS2与Linoleic acid（亚油酸）、oleic acid（油酸）、palmitic acid（棕榈酸）、stearic acid（硬脂酸）、Linolenic acid（亚麻酸）、Erucic acid（芥酸）、Stigmasterol（豆甾醇）、Vitamin E（维生素E）、(+)-catechin（儿茶素）、(-)-epicatechin（表儿茶素）、Trans-resveratrol（反式白藜芦醇）、ursolic acid（熊果酸）这 12个化合物相互作用，TNF、PLAU等多个靶点均与(-)-epicatechin（表儿茶素）、Trans-resveratrol（反式白藜芦醇）、ursolic acid（熊果酸）作用，体现了葡萄籽油多成分、多靶点协同抗癌和抗肿瘤的作用。

图2 葡萄籽油活性成分-抗癌和抗肿瘤靶点网络Fig.2 Active ingredients of grape seed oil-anti-cancer and anti-tumor target network

2.4 蛋白质相互作用网络构建

应用String在线平台对葡萄籽油的93个潜在抗癌和抗肿瘤靶点进行PPI蛋白互作网络分析，设置物种为“人类”，将蛋白相互作用评分置信度设置为0.900，隐藏离散的靶点，获得PPI网络图（如图3）。该网络中包含93个节点，482条边，平均节点度为 10.4。根据节点度值大小，关键靶点依次有信号转导子和转录激活子 3（STAT3）、丝裂原激活的蛋白激酶1（MAPK1）、丝裂原激活的蛋白激酶 3（MAPK3）、肿瘤抑制蛋白 p53（TP53）、转录因子AP-1（JUN）、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、转录因子p65（RELA）、肿瘤坏死因子（TNF）、丝裂原激活的蛋白激酶8（MAPK8）、原癌基因 c-Fos（FOS）、白介素 6（IL6）、血管内皮生长因子 A（VEGFA）、Myc原癌基因蛋白（MYC）、雌激素受体（ESR1）、半胱天冬酶 8（CASP8）、半胱天冬酶 3（CASP3）等，这些靶蛋白在PPI网络中具有重要地位，与其他多个靶点相连，可能与葡萄籽油发挥抗癌和抗肿瘤作用关系密切。

图3 葡萄籽油潜在抗癌和抗肿瘤靶点的PPI网络Fig.3 PPI network of potential anti-cancer and anti-tumor targets of grape seed oil

2.5 GO 功能富集分析

将葡萄籽油 93个潜在抗癌和抗肿瘤靶点进行GO富集分析（见图4），获得607条生物学过程条目，其中P＜ 0.05的生物学过程有477条，富集的前20个生物学功能依次为蛋白质结合（84个靶点）、相同的蛋白质结合（28个靶点）、酶结合（23个靶点）、蛋白质异二聚活性和蛋白质均二聚活性及转录因子结合（19个靶点）、蛋白激酶结合（15个靶点）、转录调控区DNA结合（14个靶点）、序列特异性DNA结合（14个靶点）、细胞因子活性（12个靶点）、RNA聚合酶II核心启动子近端区域序列特异性DNA结合（11个靶点）、转录激活子活性及RNA聚合酶II核心启动子近端区域序列特异性结合（10个靶点）、生长因子活性和蛋白质复合物结合及激酶活性（9个靶点）、蛋白酶结合（8个靶点）、半胱氨酸型内肽酶活性（6个靶点）、蛋白磷酸酶2A结合和肿瘤坏死因子受体结合（5个靶点）、BH3域结合（4个靶点），表明葡萄籽油可通过参与调控多种生物学过程而发挥抗癌和抗肿瘤作用。

2.6 KEGG 信号通路分析

对葡萄籽油 93个潜在抗癌和抗肿瘤靶点进行KEGG通路注释分析，获得119条信号通路条目，其中P＜ 0.05的通路有113条，包括大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、肾细胞癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌等通路，涉及 NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路、ErbB信号通路、mTOR信号通路、VEGF信号通路、Wnt信号通路等经典信号通路，排名靠前的条目有癌症通路、TNF信号通路、FoxO信号通路、细胞凋亡、癌症中的蛋白聚糖通路、PI3K-Akt信号通路、癌症中的MicroRNA通路、癌症中的转录失调通路、非酒精性脂肪肝病（NAFLD）、神经营养蛋白信号通路、炎性肠病（IBD）、Toll样受体信号通路、慢性粒细胞白血病、甲状腺激素信号通路、HIF-1信号通路等。由此推测，葡萄籽油可能通过调节以上信号通路来发挥抗癌和抗肿瘤作用，富集的前 20条通路分析结果见表 3。

图4 葡萄籽油潜在抗癌和抗肿瘤靶点GO富集结果柱形图Fig.4 Bar graph of GO enrichment results of potential anti-cancer and anti-tumor targets of grape seed oil

3 讨论

葡萄籽油是一种性能良好、营养价值极高、对人体无毒无害无副作用且完全符合食品卫生标准的功能型食用油脂，因其丰富的不饱和脂肪酸组成、无烟特性且加热不易产生有害物质等特点而成为近年来备受欢迎的高端食用油[13]。目前关于葡萄籽油抗癌研究较少，有研究结果显示，葡萄籽油对HT-29结肠癌细胞增殖有显著的抑制作用[21]。另有报道，葡萄籽油已被尝试作为纳米制剂的载体用于癌症的治疗[22]。根据文献报道[13，18]，葡萄籽油含有亚油酸、多酚类物质、维生素 E、植物甾醇、角鲨烯等成分，这些成分均有抗癌和抗肿瘤的生物学功能，可见葡萄籽油在治疗癌症和肿瘤方面潜力极大。本研究结果显示，反式白藜芦醇、熊果酸、表儿茶素、棕榈酸等化合物在葡萄籽油活性成分-抗癌和抗肿瘤靶点网络中与其他多个疾病靶点相连，可能是主要抗癌和抗肿瘤物质基础。反式白藜芦醇、表儿茶素均为多酚类物质，此外，豆甾醇、维生素 E、菜籽甾醇、亚油酸虽不是关键靶点，但与疾病靶点也有一定关联，说明本研究结果与文献报道相吻合。另外，角鲨烯也具有抗肿瘤作用[13]及有效预防和抑制化学诱导的结肠癌、胰腺癌、皮肤癌等多种癌症的发生[18]，可能是由于其在植物油脂中存在量较少、研究较少，所以未能在数据库中找到其作用靶点。

PPI网络分析发现，葡萄籽油抗癌和抗肿瘤的关键靶点依次为 STAT3、MAPK1、MAPK3、TP53、JUN、AKT1、RELA、TNF、MAPK8、FOS、IL6、VEGFA、MYC、ESR1、CASP8、CASP3等，这些关键靶点参与调控酶结合、蛋白质结合、转录因子结合、蛋白质异二聚活性、转录调控区DNA结合、细胞因子活性、蛋白激酶结合、蛋白质均二聚活性、BH3域结合、蛋白酶结合、生长因子活性、序列特异性 DNA结合、转录激活子活性及RNA聚合酶II核心启动子近端区域序列特异性结合、蛋白磷酸酶 2A结合、蛋白质复合物结合、肿瘤坏死因子受体结合、半胱氨酸型内肽酶活性、RNA聚合酶II核心启动子近端区域序列特异性 DNA结合、激酶活性等生物学功能，参与大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、肾细胞癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌等通路的调控，NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路、ErbB信号通路、mTOR信号通路、VEGF信号通路、Wnt信号通路等经典信号通路的调控。

综上所述，本研究采用网络药理学的方法，预测了葡萄籽油抗癌和抗肿瘤作用的功能成分及作用靶点、生物学过程与富集通路，从分子的角度探讨其抗癌和抗肿瘤作用机制，体现了葡萄籽油通过多成分、多靶点、多途径的方式来治疗癌症和肿瘤。