基于网络药理学和文献探讨异喹啉类生物碱抗肝癌研究进展

孙杏倩，蔡俊飞，高家菊，普 娟，马云淑，2✉

（1. 云南中医药大学 中药学院，云南 昆明 650500；2. 云南省高校外用给药系统与制剂技术研究重点实验室，云南 昆明 650500）

原发性肝癌是一种恶性肿瘤，其发生和发展是一个复杂而繁琐的过程，与多种因素密切相关[1]。研究表明，肝癌不能完全治愈且无有效预防，当前治疗肝癌的方法有原位肝移植、肝切除、消融技术、介入疗法、放射疗法、生物疗法、分子靶向疗法和中药治疗等[2-3]。但由于局部浸润和肝内转移，肝癌术后复发已成为棘手的问题，患者的预后很差。当前治疗方法的局限性主要是对导致疾病异质性的复杂分子信号传导过程的不完全了解，在治疗肝癌的各种方法中，天然药物治疗因其高效、易取、多靶点和副作用少等优点引起了国内外研究者的关注。

网络药理学已成为一种药物靶标分析的系统方法，抗癌药物需要开展大量的基础研究和应用研究[4-5]，从系统角度和分子水平上发现中药，将研究方式从当前的“一种靶标，一种药物”模式变为新的“网络靶标，多组分”模式，建立了一种新颖的中药网络药理方法[6]。Guo等[7]基于网络药理学预测小檗碱在多种癌症的预防和治疗中的多种药理作用。

异喹啉生物碱是以异喹啉或四氢异喹啉为母体的最大生物碱类，多种药理活性，如抗肿瘤、抗心律失常、镇痛、抗炎等[8-10]。该生物碱已显示出通过多种机制发挥显著的抗肝癌作用，包括抑制增殖，诱导细胞凋亡和自噬，转移和血管生成，调节各种与癌症相关的基因及途径等[11-12]。除了单独使用之外，发现与其他化疗药物合用能够产生协同作用。通过网络药理学，对五种药物治疗肝癌进行筛选，并展示其潜在机制。总体来说，基于现有文献总结和网络药理学，可以解释多种药物治疗肝癌的机制，可能为进一步治疗肝癌等疾病提供启示。本文主要阐述异喹啉类生物碱在肝癌治疗方面的作用及其潜在作用机制，为肝癌的相关研究提供参考与借鉴。

1 异喹啉类生物碱基本概况

生物碱（过去称为嘌呤）是自然界中普遍存在的一类含氮碱性有机化合物，具有类碱性质，且大多具有复杂的环状结构，环中含有氮，具有显著的生物活性。异喹啉生物碱是生物碱中最重要的类型之一，迄今为止，已从小檗科、防己科、豆科、毛茛科等10种植物中检测到4 000多种异喹啉生物碱[13]。本文根据文献报道的频率在不同类别中着重介绍以下五类生物碱：小檗碱（Berberine，BER）又称黄连素，为季铵原小檗碱类异喹啉生物碱、汉防己甲素（Tetrandrine，TET）又称粉防己碱，为双苄基异喹啉类生物碱、血根碱（Sanguinarine，SAN）为α-萘菲啶类生物碱、青藤碱（Sinomenine，SIN）为吗啡烷类生物碱，石蒜碱（Lycorine，LYC）为吡咯菲里啶类生物碱[14]。生物碱具有广泛的药理活性，且结构多样，越来越多的学者把目光投向了生物碱。其中以小檗碱研究肝癌的文献居多，图1为近几年五种异喹啉类生物碱研究肝癌的文献数量情况。

图1 2012—2019年五种异喹啉类生物碱研究肝癌的文献数量Fig.1 Literature number of five isoquinoline alkaloids in liver cancer studies from 2012 to 2019

2 基于网络药理学数据库分析

2.1 异喹啉类生物碱抗癌的潜在作用靶点预测

利用 Genecard数据库平台，检索“liver cancer”并筛选相关评分≥5的基因，其中得到肝癌疾病的潜在靶点分别为2 816个，利用R预言绘制维恩图（见图2），其中与肝癌相关的关键靶点基因共有33个。

图2 肝癌靶点基因与异喹啉生物碱靶点基因的匹配图Fig.2 Matching of liver cancer target genes with isoquinoline alkaloid target genes

2.2 药物-活性成分-关键作用靶点网络构建分析

对上述异喹啉类生物碱 5个主要成分进一步通过 TCMSP数据库搜索潜在靶点 68个，采用Cystoscope软件构建异喹啉生物碱-活性成分-功能-靶点网络图（见图3），包含58个节点（1个为异喹啉，5个活性组分与52个靶点），组成73条边异喹啉类的活性成分与记忆靶点之间相互关系。靶点最多的成分是粉防己碱、节点最多的靶点的靶点是肾上腺素能受体（Recombinant Adrenergic Receptor Beta 2，ADRB2）、类视黄醇 X 受体（A Retinoid X Receptor，Alpha，RXRA）、烟碱型乙酰胆碱受体（A7 Nicotinic Acetylcholine Receptor，ACHA7）等，提示六种活性成分通过多成分、多靶点作用来预防肝癌的发生和发展，通过参与调控肝癌细胞增殖、分化、凋亡、炎症等过程。

图3 异喹啉生物碱5种主要成分与相关靶点的网络图Fig.3 Network diagram of 5 main components of isoquinoline alkaloids and related targets

2.3 关键靶点基因蛋白质相互作用网络分析

将异喹啉类五种生物碱抗肝癌治疗的 52个潜在靶点基因导入STRING数据库平台，选择物种为人，获取蛋白质相互作用关系（见图4），排除三个游离的（无相互作用的蛋白），该网络图共包括 28个节点，91个边。其中综合数值评分＞0.999的相互作用蛋白有11个，其中前五个蛋白分别为抑癌基因 p53基因（Tumor Suppressor gene，p53）、核受体共激活剂 2） （Nuclear Receptor Coactivator 2，NCOA2、白介素2（Interleukin-2，IL-2）、细胞周期素依赖性激酶抑制因子1A（Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 1A，CDKN1A）、细胞周期蛋白依赖性激酶4（Cyclin Dependent Kinase 4，CDK4）。文献查阅发现，p53是肝癌细胞增殖和凋亡等生物学过程中的重要靶标[15]；小檗碱和血根碱均可提高p53的水平，从而抑制肿瘤细胞生长，血根碱可通过p53介导的细胞增殖、凋亡等，还可参与细胞周期蛋白酶，来治疗肝癌[16-17]。

图4 异喹啉类抗肝癌相关基因的蛋白质相互作用网络Fig.4 Protein interaction network of isoquinoline anti-hepatocellular carcinoma genes

2.4 生物信息学分析

图5 相关蛋白质靶点的GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of related protein targets

利用WebGestalt分析软件对相关靶点蛋白进行功能注释分析（见图5），包含生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF），这些蛋白在生物过程方面主要参与生物调节、刺激反应等过程；在细胞方面主要参与构成细胞膜、细胞核和腔上包膜等过程；在分子功能方面与蛋白结合，生长因子受体结合，大分子复合物结合以及蛋白结合等功能，结论五种化合物抑制肝癌生长可能与以上功能过程相关。

2.5 KEGG 通路分析

利用WebGestalt分析软件对相关靶点蛋白进行KEGG通路富集分析发现（见图6）异喹啉类生物碱对治疗肝癌的靶标主要与炎症性肠病、胰腺癌、慢性粒细胞白血病、Th17细胞分化、对小细胞肺癌和非小细胞肺癌、钙离子信号通路和PI3K/Akt信号通路、松弛信号通路、雌激素信号通路传导途径等通路。与基础研究相互吻合，提示以上结果表明五种生物碱类可通过各通路协同发挥作用。

图6 相关靶点KEGG通路富集分析的前30条通路Fig.6 The first 30 pathways in enrichment analysis of KEGG pathways of related targets

3 基于文献分析异喹啉类生物碱抗肝癌的作用机制

3.1 诱导肿瘤细胞周期阻滞

细胞周期是包括G0/G1，S和G /M期等的生理过程，细胞增殖受细胞周期调控，细胞周期受一系列细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）及其关键抑制剂的调控[18]。研究表明小檗碱可以对多种肝癌细胞有抑制作用，用小檗碱处理 Huh-7和HepG2细胞后观察到在细胞周期G0/G1期停滞[19]。FoxO3a（叉形头转录因子的O亚型，在癌症中表达常下调）和Skp2（p45蛋白，在许多人类癌症中表达上调）均可参与细胞增殖，促进细胞周期停滞，小檗碱可以通过Huh-7和HepG2肝癌细胞中的 Akt/FoxO3a/Skp2轴诱导生长抑制和细胞周期停滞。张志敏等[20]发现小檗碱可抑制肝癌HepG2细胞的增殖，通过上调抗增殖基因（BTG2）和下调细胞周期蛋白（CyclinD1）。Tan等[21]研究发现不同剂量的小檗碱对人肝癌细胞株HepG2有抑制作用，采用流式细胞术发现高剂量组观察到亚G0期和G0/G1的增加，且证明蛋白质组分析获得的数据与我们通过流式细胞术进行细胞周期分析所获得的数据一致。血根碱能诱导 HepG2和SMMC-7721细胞的S细胞周期停滞[22]。

3.2 诱导细胞凋亡

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，能有序而有效地移除受损的细胞，细胞凋亡的基本调控因子包括激活抗凋亡因子 B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）等或失活促凋亡因子（即p53途径）[23]。研究发现抑制p53表达可能会阻止小檗碱诱导的miR-23a的上调，当 miR-23a被抑制时，小檗碱对肝癌细胞 G2/M 细胞周期阻滞、细胞凋亡作用减弱和体内肿瘤生长抑制作用也将减弱[24]。在体内外，小檗碱均可通过抑制C-myc基因（C-myc）抑制谷氨酰胺转运体（SLC1A5）表达、干扰谷氨酰胺代谢，从而抑制肝癌细胞的增殖[25]。wan等[26]发现血根碱及其衍生物能够诱导肿瘤细胞凋亡，其可能是下调Bcl-2和上调Bax（凋亡基因），抑制DNA拓扑异构酶I/II的活性，从而导致细胞凋亡。ROCK1（蛋白激酶 1）的激活在蛋氨酸诱导的线粒体凋亡中起关键作用，石蒜碱在体内能抑制HepG2异种移植的肿瘤生长，并通过线粒体依赖性途径诱导 HepG2细胞凋亡[27]。研究显示[28]石蒜碱可促进人肝癌HepG2细胞凋亡，机制可能与半胱氨酸蛋白酶（Caspase） Caspase-9、-3、Cyt-C（细胞色素 C）表达水平的升高、Bcl-2蛋白表达的降低有关。粉防己碱使 HepG2、Huh-7和PLC/PRF/5肝细胞瘤细胞出核碎裂和细胞凋亡等特征[29]。血根碱通过诱导活性氧（ROS）相关的凋亡，以p53依赖性方式显着抑制HCC细胞增殖。血根碱诱导HepG2和SMMC-7721细胞的早期凋亡，在体内发现血根碱（10 mg/kg）同样可以对肝癌生长起抑制作用，且能明显减少HepG2裸鼠移植瘤模型的瘤体重量，其机制与增加了miR-16-2启动子上p53的占有率、降低了miR-16靶基因的表达有关[30]。血根碱也可通过诱导ROS发挥抗增殖作用，并通过线粒体和caspase依赖性途径引起细胞凋亡。

3.3 诱导细胞自噬

自噬是一个由细胞质中的细胞成分介导的动态过程，是细胞存活和细胞死亡（自噬细胞死亡）之间的平衡机制，靶向自噬的治疗药物可能对癌细胞有抑制作用[31]。葡萄糖调节蛋白78（GRP78）是自噬诱导剂，在自噬调节中起主导作用。研究表明，小檗碱可以通过激活化转录因子6（ATF6）裂解，抑制泛素化和蛋白酶体降解来诱导GRP78表达，从而进一步导致自噬和细胞死亡[32]。小檗碱也可通过细胞中的AMPK（AMP依赖的蛋白激酶）激活和乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的失活来诱导HepG2的凋亡和自噬[33]。粉防己碱是一种广谱有效的自噬激动剂，在HCC细胞中，低剂量的粉防己碱（5μM）诱导（自噬体）膜型LC3-II的表达，导致酸性自噬酶体液泡（AVOs）的形成，可以有效诱导多种细胞系自噬[34]。另外，ROS的产生在促进粉防己碱诱导的自噬中起重要作用，能诱导的肝癌细胞凋亡以Caspase依赖性方式发生。

3.4 抑制肿瘤细胞侵袭转移

上皮间充质转化（EMT）被认为是最初可逆的生物学过程，癌细胞中的部分EMT被认为可以增强其侵袭性，产生循环的肿瘤细胞和癌细胞干细胞，并增强对抗癌药物的抗性，在肿瘤中影响显著[35]。小檗碱可能通过调控转化生长因子-β(TGF-β)/Smad信号通路，干预HepG2细胞的EMT进程，抑制HepG2细胞的迁移和侵袭能力[36]。KLF6（转染抑癌基因）在肝癌中通过丢失或突变来失控，并且其失活可能诱发肿瘤，小檗碱能通过抑制野生型 KLF6的过表达，从而抑制肝癌细胞的增殖和迁移[37]。小檗碱通过诱导肝癌细胞中的纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）表达并抑制尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）来抑制 uPA受体，结果表明PAI-1的上调和uPA受体的下调与小檗碱抑制HCC细胞的侵袭和运动有关[38]。Id-1（分化抑制因子）的表达与HCC的增殖、转移和血管生成有关。小檗碱的治疗可以有效抑制Id-1表达并抑制肝细胞癌转移[39]。转移性肿瘤抗原1（MTA1）与肿瘤的侵袭和迁移有关，通常在癌症（例如肝癌）中高表达。在肝癌的体内外实验中发现汉防己甲素能够通过自噬依赖抑制 Wnt /β-链接素（β-catenin）信号通路和降低 MTA1表达来抑制转移[40]。粉防己碱治疗明显降低了MTA1的表达，这表明粉防己碱可以通过MTA1抑制HCC迁移。卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK1）是一种多功能蛋白，可调节各种细胞功能，石蒜碱可激活ROCK1，从而影响肌动蛋白的细胞骨架动力学，达到抗肝细胞生长和迁移的作用[41]。

3.5 抗肿瘤血管生成

血管生成是新血管从现有血管中生长的过程，血管生成可以通过肿瘤细胞分泌的生长因子来启动，从而为肿瘤提供更多的氧气和营养。越来越多的临床前研究和临床试验表明，可通过抑制血管生成来抑制肿瘤生长[42]。血管生成靶标包括血管内皮生长因子及其受体（VEGF/VEGFRs），整联蛋白（Avb3）和基质金属蛋白酶（MMP）。小檗碱是一种有效的抗血管生成剂，其作用主要是通过抑制多种血管生成因子如血小板内皮细胞黏附分子（CD31）和VEGF，同时小檗碱可通过抑制炎症和血管新生，预防非酒精性脂肪性肝炎衍生的肝细胞癌[43]。

3.6 抑制环氧合酶2（COX-2）

环氧合酶2（COX-2）是脂肪酸代谢中的关键酶，在炎症部位由促炎细胞因子诱导的COX-2和增强的COX-2诱导的前列腺素合成，可刺激癌细胞增殖，促进血管生成，抑制凋亡并增加转移潜力[44]。花生四烯酸（AA）的代谢途径已经与多种癌症的发生和发展相关。研究发现，用小檗碱处理 HCC细胞后，胞浆型磷脂酶 A2（cPLA2）和COX-2的蛋白表达水平受到剂量依赖性的显著抑制，而凋亡诱导因子（AIF）和AA与PGE2的含量比显著增加。小檗碱可通过抑制HCC中的AA代谢途径来诱导细胞凋亡[45]。袁婉雯等[46]发现青藤碱可以诱导肝癌细胞 HepG2阻滞在G1期，其机制可能是抑制COX-2的表达、降低肿瘤细胞中Bcl-2蛋白的含量，或通过抑制PI3K/AKT信号通路，均可诱导HepG2细胞的凋亡。

3.7 抑制NF - kB的活性

核因子κB（NF-κB）蛋白家族成员的二聚体结合形成的诱导型转录因子集合的总称。该家族五个成员为（RelA，RelB，c-Rel，p50和p52）。在所有恶性肿瘤中，NF-κB以细胞类型特异性的方式起作用，激活癌细胞内的生存基因和肿瘤微环境成分中的促炎症基因，NF-κB的组成性激活并伴有（IκB蛋白）IκBα失调在肝癌发生中起到重要作用[47]。实时荧光定量PCR和免疫荧光染色均显示小檗碱可降低 HepG2细胞中的 NF-κBp65水平，p65的过量表达抑制了小檗碱诱导的细胞增殖，并阻止了HepG2细胞凋亡[48]。

3.8 逆转肿瘤细胞多药耐药性

在化疗药中多药耐药性（MDR）仍然是治疗癌症的主要挑战，MDR其特征是 ATP依赖性药物外排转运蛋白的过度表达[49]。寻找抗 MDR活性的新化合物是解决该癌症耐药性问题的一种有效的方法。索拉非尼耐药是影响肝细胞癌患者预后的主要因素之一，索拉非尼和小檗碱组合对SMMC-7721和HepG2细胞的增殖有协同抑制作用，呈剂量依赖和时间依赖[50]。Ki67（繁殖基因）是一种增殖细胞相关的基因，化合物 HMQ1611（BCH）和小檗碱合用对HCC增殖和集落形成具有良好的抑制作用，BCH通过抑制细胞周期素（Cyclin）CyclinD1、CyclinE和蛋白激酶（Cdc2）的表达。同时，BCH通过下调Ki67和β-catenin以及上调轴蛋白（Axin）和p-β-catenin来显著抑制SMMC-7721异种移植肿瘤的生长。提示BCH和小檗碱协同用药后在体外和体内均表现出对人肝癌的潜在抗肿瘤活性，而这些活性的潜在机制取决于对 Wnt /β-catenin信号通路的影响[51]。刘城等[52]研究发现青藤碱与 5-FU联合用药能抑制肝癌细胞系SMMC7721的增殖，且两药联合应用时，凋亡及坏死细胞比例显著高于两药单用时，提示两药合用在抗肝癌作用中可能存在协同作用。王云等[53]发现青藤碱与二甲双胍的协同用药对肝癌移植瘤有抑制作用，其机制可能与TGF-β/P38信号通路的激活有关。

3.9 增强辐射敏感性

化疗和放射疗法的同时治疗有可能为患者改善疾病有诸多益处。在药理和临床研究中，抗肿瘤剂不仅可以与其他化学治疗剂结合使用，还可以与放射线结合使用，以使细胞对放射线敏感，从而增强癌症的治疗功效。小檗碱抑制 Huh7和HepG2细胞中 Nrf2（NF-E2-relatedfactor2）信号相关蛋白的表达，表明小檗碱可通过抑制HCC细胞中的Nrf2信号传导途径来增强放射敏感性[54]。将人肝癌 HepG2细胞用黄连素联合照射进行处理，小檗碱可显着增强γ射线的抗肿瘤作用，其机制通过p38 MAPK途径和ROS的产生增强了抗癌作用[55]。蛋白酶体激活因子（PA28γ）上调在包括肝癌在内的许多恶性肿瘤的癌变过程中起着至关重要的作用。粉防己碱可增强HepG2和LM3细胞的放射敏感性且随着粉防己碱剂量的增加，放射敏感性增强[56]。

4 讨论

肝癌是世界上死亡率较高的最常见的浸润性肿瘤，寻找有效的药物来治疗恶性肿瘤是一个急需解决的难题。生物碱具有来源丰富、结构多变、效果显著及毒副作用小等优势，随着研究日益深入和广泛应用，异喹啉类生物碱大部分都具有抗肿瘤活性，抗肿瘤靶点和通路比较复杂多样，不同实验研究中选择的肿瘤细胞和模型区别较大，对大量基础研究数据进行阶段性回顾分析也具有一定的意义。

通过网络药理学和文献总结，构建“异喹啉类生物碱-靶点-基因-肝癌”体系，找出共同的靶点基因，建立了蛋白互作网络，进行GO富集和KEGG富集，发现异喹啉类生物碱主要是通过钙离子和 PI3K-Akt等信号通路与体内生物过程的方式治疗肝癌的，验证基于网络药理学的方法对发现生物活性化合物以及阐明作用机理的有效性，并试图在两者之间建立联系，扩展异喹啉类生物碱-肝炎体系的多分子，多靶点，多通路的作用机制，为异喹啉类生物碱治疗肝癌的具体机制克服了理论基础，为异喹啉类生物碱的进一步研究提供新的研究策略。