神经干细胞与脊髓脱细胞支架体外共培养的可行性

漆国栋，江琼，伍亚民，申开琴，杨琴，漆伟

1.重庆市中医骨科医院骨科，重庆市 400010；2.重庆医科大学中医药防治代谢性疾病重庆市重点实验室，重庆市 400016；3.陆军军医大学大坪医院野战外科研究所，创伤烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆市400042

脊髓损伤致残率高，严重影响患者生活质量。目前临床康复采用多学科协同方案，但效果有限[1]。种子细胞与生物支架构建的脊髓组织工程可能成为未来脊髓损伤康复的关键方向，现阶段重点为选择不同种类细胞与支架，探索最适宜的构建方案[2-3]。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)源于神经组织，作为种子细胞中最能定向分化为神经谱系的细胞，可直接代替损伤的神经样细胞，分泌多种神经营养因子，改善损伤处微环境，但存在单独应用时存活率较低、分化不可控等缺点[4-6]。脊髓脱细胞支架(spinal cord acellular scaffold,SCAS)为正常脊髓组织经脱除细胞后保留的细胞外基质，成分和结构与正常脊髓高度相似，具有低免疫原性和良好的生物相容性[7]。将骨髓间充质干细胞种植于SCAS，发现该细胞与支架复合良好，可生存、生长并分化为神经谱系细胞[8-9]。本课题组前期对体外培养的NSCs增殖与分化调控进行探索[10-12]，结合相关文献发现NSCs 具备复合生物支架构建脊髓组织工程的可行性[13]。本研究选择NSCs 作为种子细胞，与SCAS 进行脊髓组织工程构建，初步探讨该模式的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂与仪器

SPF 级 新 生24 h Sprague-Dawley 大 鼠、SPF 级Sprague-Dawley 雌性大鼠，购自重庆医科大学动物实验中心，动物生产许可证号SCXK(渝)2012-0001。所有操作均依据《医学实验动物管理实施细则》要求，符合动物福利与伦理原则。

Neural basal 培养基、B-27、Acctuase 酶、胎牛血清：美国GIBCO 公司。碱性纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)：美国PEPROTECH 公司。小鼠单克隆抗Nestin 抗体：美国MILLIPORE 公司。兔多克隆抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体：美国INVITROGEN公司。小鼠单克隆抗微管相关蛋白-2 (microtubule associated protein-2,MAP-2)抗体：英国ABCAM 公司。DMEM/F12 培养基、0.25%胰酶：美国HYCLONE 公司；DyLight488标记山羊抗小鼠二抗、TRITC 标记山羊抗兔二抗、DAPI、HE 染色试剂盒、免疫组化染色试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司。TritonX-100、脱氧胆酸钠、PBS、正常山羊血清：北京索莱宝科技有限公司。激光共聚焦显微镜、冰冻切片机：德国LEICA 公司。荧光倒置显微镜：日本OLYMPUS 公司。冷冻干燥机、细胞培养箱、-80 ℃冰箱：美国THERMO FISHER SCIENTIFIC公司。扫描式电子显微镜：日本HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 NSCs

1.2.1.1 原代培养及传代

新生24 h 内大鼠5 只，断头取脑。无菌条件下仔细剥离脑膜和血管，眼科镊前缘解剖分离大脑皮质，锋利剪刀剪成1 mm3小块。加适量0.25%胰酶，37 ℃消化15～20 min；胎牛血清终止消化，蓝枪头均匀用力吹打10～15 次，200 目细胞筛过滤，形成单细胞悬液。离心，弃上清液，加适量培养基吹打、重悬。重复离心、重悬步骤。细胞计数，以1×106/ml 接种于6 cm培养皿中，增殖培养基含DMEM/F12、2%B-27、20 ng/ml EGF 和20 ng/ml bFGF，培养箱中培养。每2～3 d 半量换液1 次，6～7 d 传代1 次。传代时，细胞悬液离心，弃上清液，Acctuase 酶吹打、重悬，37 ℃消化10 min；离心，去Acctuase 酶，加培养基，均匀用力吹打30～50 次，加入适量增殖培养基重悬。传代后培养方式同原代。

1.2.1.2 鉴定

1.2.1.2.1 Nestin鉴定

取第3 代神经球，接种于多聚赖氨酸包被的六孔板无菌爬片中培养4 h 贴壁。4%多聚甲醛固定，0.5%TritonX-100 破膜，10%山羊血清封闭。加Nestin 一抗(1∶200) 4 ℃孵育过夜。加Dylight488 标记山羊抗小鼠二抗(1∶100)37 ℃孵育1 h。DAPI 染核，抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察。

1.2.1.2.2 分化鉴定

取第3 代神经球吹散后，接种于多聚赖氨酸包被后的六孔板无菌爬片中分化培养7 d，分化培养基含Neural basal、2%B-27和10%胎牛血清。4%多聚甲醛固定，0.5% TritonX-100 破膜，10%山羊血清封闭。加Map-2 (1∶500)、GFAP(1∶1000)一抗4 ℃孵育过夜。加Dylight488 标记山羊抗小鼠(1∶100)、TRITC标记山羊抗兔(1∶100)二抗37 ℃孵育1 h。DAPI染核，抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察。

1.2.2 SCAS

1.2.2.1 制备

雌性Sprague-Dawley 大鼠20 只，1%苯妥英钠45 mg/kg 腹腔注射麻醉，无菌条件下经心脏灌注无菌PBS。完全取出胸段脊柱，置0 ℃D-hanks 中。取部分完整脊髓(正常脊髓)，修剪为10 mm 左右小段，-20 ℃保存。

取部分脊髓(SCAS)，置-80 ℃冰箱1 h，-20 ℃、4 ℃、37 ℃梯度解冻，无菌蒸馏水浸泡6 h，每2 小时换水1 次。脊髓修剪为10 mm 左右小段，依次浸入2%TritonX-100 溶液，超声振荡5 min (振幅20%，振5 s 停5 s)，室温持续振荡3 h (170 r/min)；置0.01 mol/L PBS 持续振荡3 h；置10%氯化钠溶液持续振荡15 min；置纯水持续振荡15 min；置10%氯化钠溶液持续振荡15 min；置纯水持续振荡15 min；置2%脱氧胆酸钠溶液，超声振荡5 min (振幅20%，振5 s 停5 s)，室温持续振荡3 h (170 r/min) ；置0.01 mol/L PBS持续振荡3 h。-20 ℃保存。

1.2.2.2 检测

1.2.2.2.1 孔隙率

采用液体置换法。冻干脊髓各5 条置量筒中，加入V1 体积无水乙醇中，轻压脊髓组织中空气至无气泡，此时体积为V2；将脊髓移出，此时体积为V3。

1.2.2.2.2 含水率

冻干脊髓各5 条称重(W1)，置0.01 mol/L PBS 中浸泡2 h，吸出多余水分，称重(W2)。

1.2.2.2.3 体外酶解率

冻干脊髓各5 条称重(W1)，置含1 mg/ml 胰蛋白酶PBS中，37 ℃、100 r/min振荡24 h取出，冻干后称重(W2)。

1.2.2.2.4 组织学观察

冻干脊髓4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脱水，冰冻切片，HE染色，中性树胶封片。光学显微镜观察。

1.2.3 体外共培养

取第3代神经球吹散，调节细胞浓度为5×106/ml，微量注射器取20µl接种于SCAS 中，培养箱孵育4 h，加分化培养基Neural basal、2% B-27 和10%胎牛血清，培养箱培养，每2～3 d换液1次。

1.2.3.1 免疫荧光染色

共培养1 d 后，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脱水，冰冻切片，0.5% TritonX-100 破膜，10%山羊血清封闭。DAPI 染细胞核，抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察细胞黏附情况。

1.2.3.2 免疫组化染色

共培养7 d 后，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脱水，冰冻切片，过氧化氢灭活，5% BSA 封闭，加MAP-2 一抗(1∶100)4 ℃孵育过夜，加生物素标记二抗37 ℃0.5 h，SABC 37 ℃0.5 h，DAB 显色，苏木素复染，中性树胶封片，光镜下观察细胞生长与分化情况。

1.2.3.3 扫描电镜

共培养7 d 后，2%戊二醛固定，手术刀横向切开，梯度酒精脱水，叔丁醇置换，粘台，临界点干燥，喷金，扫描电镜下观察细胞生长与分化情况。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0 软件统计分析相关数据。计量资料符合正态分布，以(±s)表示，采用独立样本t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 NSCs鉴定

原代细胞接种6～7 d 后，可见神经球增殖、融合变大，直径可达到150～300 μm，呈球形、桑葚状，透光性强(图1A)。第3 代神经球95%以上细胞表达Nestin 蛋白(图1B、图1C)。分化培养7 d 后，可分化为神经样细胞(图1D)，表达MAP-2 蛋白(图1E)和GFAP 蛋白(图1F)，符合NSCs分化特点。

2.2 SCAS基本特征

正常大鼠脊髓呈圆柱状，乳白色，稍有黏性(图2A)。物理振荡结合化学萃取过程中，萃取液变浑浊，脱细胞的脊髓略短缩，呈圆柱状，乳白色，透光性增加，强度有所下降，黏性略有增加，硬脊膜保持完整(图2B)。脱细胞脊髓的孔隙率、含水率与体外酶解率较正常脊髓均明显提高(P<0.01)。见表1。正常脊髓细胞外基质结构致密，基质可见较多完整细胞核(图2C、图2D)。SCAS 基质结构呈疏松网络状，基质上可见极少量残留细胞核(图2E、图2F)。

表1 SCAS与正常脊髓特性比较(%)

2.3 体外共培养

共培养1 d 时，NSCs 散在黏附于支架上(图3A、图3B)。共培养7 d 时，NSCs 在支架上逐渐分化为神经元和神经胶质细胞；神经元发育良好，胞体丰满，形态各异，轴突清晰，部分神经元轴突间建立稳定联系，形成轴突网络(图3C、图3D)。共培养7 d 时，细胞良好黏附于支架上，神经胶质细胞在神经元之下，并分泌相关物质，可见神经元轴突间相互连接；神经元发育良好，轴突可深入支架基质孔隙中(图3E、图3F)。

图1 NSCs鉴定(bar=100 μm)

图2 正常脊髓与SCAS形态学观察

3 讨论

脊髓损伤康复临床路径包括急性期重建脊柱和神经减压外科治疗，以及亚急性和后期综合康复[14]。随着组织工程在各领域研究的日益广泛，课题组提出脊髓组织工程5R 疗法设想[15]，即先通过外科手术挽救(Rescue)脊髓功能，随后引入脊髓组织工程，通过支架上种子细胞促进受损脊髓再生(Regeneration)和替代(Replacement)受损神经样细胞，然后支架的桥接作用增强再髓鞘化(Remyelination)，在各种因素的协同作用下，获得最大程度康复(Rehabilitation)。

图3 细胞和支架体外共培养

由于脊髓神经的特殊性，选择不同种类细胞与支架进行构建可能导致不同结果。胚胎干细胞与纤维蛋白支架构建导致细胞存活率降低，巨噬细胞浸润增加[16]。在自组装肽纳米纤维支架中培养灵长类NSCs，分化率与常规培养无显著性差异[17]。探索适宜的构建有重要意义。评估一项新构建的效果，通常先进行体外共培养，即将细胞种植在具有三维结构的支架上，使细胞在支架中迁移和生长，最终形成细胞-支架复合体。

NSCs 是一种组织特异性干细胞，来源于神经上皮，具有自我更新和定向分化的潜能。相较其他来源的干细胞，NSCs 更可能定向分化为神经谱系细胞[18]。将NSCs 与壳聚糖-明胶支架共培养，发现能促进NSCs 的黏附与生长，并向神经元与星形胶质细胞分化[19]。本研究以大脑皮质来源的NSCs 作为种子细胞，选用能保持干细胞特性的原代方式进行培养，发现NSCs 聚集成桑葚状神经球，直径可达150～300 μm，高于常规生物材料的内部孔隙间距，直接以神经球方式接种，难以将NSCs种植入支架内，也不便于观察。可通过常规传代时胰酶消化加机械吹打，将神经球吹散为单个细胞[20]，但由于消化时间过长或吹打过度等原因，导致NSCs 活力降低甚至凋亡。本课题组采用温和的Acctuase 酶进行消化，获得单个的细胞更利于传代培养与后续共培养[21]。

已有研究表明[22]，SCAS 可以桥接大鼠受损脊髓，并促进损伤后轴突再生和运动功能康复。但相对于脱细胞真皮基质[23]，脊髓组织脱细胞研究较少，可能与脱细胞时间长(数十小时)、细胞脱去不彻底、基质结构破坏严重而引起失败率较高有关[24]。目前国内外相关研究多采用物理结合化学萃取，辅以交联剂对经历长时间脱细胞过程而受损的基质结构进行交联[25-26]。本课题组实际操作中发现，该方法存在制备时间过长、交联剂可能存在化学毒性等问题。因此，本研究对SCAS 制备的方法进行优化，避免使用未知毒性的交联剂，通过调节振荡、冻融等相关参数，引入超声振荡与高低渗交替辅助裂解细胞法，大大缩短制备时间，并在脱除细胞的情况下最大限度保留基质结构。检测表明，本研究优化的脱细胞法可去除绝大部分细胞，较完整保留细胞外基质成分与结构。

在此基础上，本研究将稳定传代的NSCs 与脱去细胞并保留完整基质的SCAS用于构建脊髓组织工程，观察细胞在支架上的黏附、生长与分化情况，发现NSCs 在支架上黏附较好，可在支架上逐渐分化为胞体丰满、形态各异、轴突清晰的神经元和神经胶质细胞，且分化后的神经元轴突间建立稳定联系，形成的轴突网络还可深入支架基质孔隙中。

综上所述，本研究制备的SCAS 脱细胞较彻底，具有多通道空间结构，在体外共培养过程中适合NSCs 黏附、生长与分化，构建脊髓组织工程具备一定可行性。未来该类构建仍需要开展更多动物实验评估移植后的效果与不良反应。相信以NSCs 与SCAS构建的脊髓组织工程能够为康复医学脊髓损伤领域提供新的应用可能。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。