新型磁分离直接化学发光方法的建立及其临床应用

宋 宇 刘 鹏 李 武 袁锦云 丛海燕 鞠 毅 姚继承 王明义▲

1.威海市立医院中心实验室，山东威海 264200；2.深圳市新产业生物医学工程股份有限公司，广东深圳 518052；3.威海威高生物科技有限公司，山东威海 264200

随着医疗技术水平不断提高，对微量物质的定量检测有了更高的要求，许多免疫检测方法也得到了不断的改进和完善。长久以来，放射免疫分析法（RIA）、酶免疫分析法（EIA）、荧光免疫分析法（FIA）是临床用于免疫定量分析的常用方法[1]。由于上述方法存在污染人体和环境、影响因素多、灵敏度不高、反应时间太长、操作过程中难以规范化等缺点[2-5]，化学发光免疫分析法（LCIA）的应用成为一种新型的定量分析技术。其多采用酶促化学发光或吖啶酯标记的直接化学发光法及三联吡啶钌标记的电化学发光等方法，但这些方法也存在试剂稳定性差、发光过程过短等问题。因此，针对上述现有检测方法中技术面的局限性和不足之处，本研究致力于建立一种新型的磁分离直接化学发光方法。

甲状腺是人体非常重要的器官，其分泌的激素可以调节人体新陈代谢，也为人体生长提供蛋白质。甲状腺一旦功能紊乱，分泌的激素失衡，会对人体产生非常大的影响，如免疫力下降，病菌入侵人体，导致各种疾病发生[6]。因此，本研究以血清促甲状腺激素（TSH）为例，介绍新型磁分离直接化学发光方法对激素等其他微量活性物质定量检测的临床价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 新型磁分离直接化学发光方法建立材料的来源

异鲁米诺衍生物购自Sigma 公司，羊抗FITC 多克隆抗体购自Thermo Scientific 公司，免疫纳米磁性微珠购自深圳市尊业纳米材料有限公司，NaOH 和H2O2购自苏州亚科科技股份有限公司。TSH 检测试剂、校准品、质控品和定标液均购自圳市新产业生物医学工程股份有限公司。

1.1.2 临床标本验证

1.1.2.1 标本来源 选取2019年8月～2020年8月威海市立医院初诊的104例甲状腺功能亢进症患者血清作为甲亢组，121例甲状腺功能减退患者血清作为甲减组，以同期来体检的134例健康成年人血清作为正常对照组。甲亢组中，男59例，女45例；年龄18～65岁，平均（41.34±9.76）岁。甲减组中，男68例，女53例；年龄18～69岁，平均（45.05±11.72）岁。对照组中，男73例，女61例；年龄18～66岁，平均（40.37±9.69）岁。分别收集各组患者无抗凝剂采血管（红管）中临床血清标本，于-20℃冰箱保存，复溶后2～8℃冰箱保存，24 h内完成实验。

1.1.2.2 仪器 ADVIA Centaur XP 全自动化学发光免疫分析仪（西门子），全自动化学发光测定仪Snibe 4000 Plus（深圳市新产业生物医学工程股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 异鲁米诺衍生物标记的单克隆抗体的制备

取3.2 mmol N-（6-氨基已集）-N-乙基异鲁米诺（AHEI）和3.5 mmol 二氯硫化碳（CSCl2）分别溶解于0.2 mL 二次水和0.3 mL 二甲基甲酰胺（DMF）中，再将二者混匀，室温条件下反应2 h。采用pH 9.5 碳酸盐缓冲液将10 mg 抗TSH-α 单克隆抗体调体积到1 mL，再加入上述活化的AHEI 溶液，混合均匀后，室温条件下反应20 h，将溶液过G-25 凝胶柱纯化。

1.2.2 FITC 标记TSH 单克隆抗体的制备

采用pH 9.5 的碳酸缓冲液将10 mg 抗TSH-β单克隆抗体调体积到1 mL，再向溶液中加入100 μg FITC，混合均匀，置于室温反应20 h，将溶液过G-25凝胶柱纯化。

1.2.3 羊抗FITC 多克隆抗体包被的免疫纳米磁性微珠的制备

纳米磁性微珠的表面含有0.3 eq/g 的羧基基团（-COOH）；取10 mL 浓度为30 mg/mL 的磁珠，用磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.4 0.01 M）清洗2 遍，最后再用10 mL 的PBS（pH 7.4 0.01 M）溶液重悬，向悬液中加10～100 μL 的50%戊二醛溶液，使戊二醛终浓度为0.01%～0.5%，再加入100～1000 μg 纯化的羊抗FITC IgG 抗体，37℃条件下反应2 h，在磁铁上去上清，用含0.01%～1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS（pH 7.4 0.01 M）清洗3 遍，最后悬浮在该PBS 溶液中，并加入0.01%～0.5%的NaN3。

1.2.4 新型磁分离直接化学发光试剂制备及应用结果分析

取TSH 标准品和血清标本各20 μL，并向其中加入发光标志物单克隆抗体的AHEI 和FITC 单克隆抗体各40 μL，混匀，于37℃条件下水浴15 min；待抗原抗体反应后加入40 μL 羊抗FITC 多克隆抗体包被的免疫纳米磁珠分离试剂，混匀，水浴5 min，通过外加磁场作用，于分离器上分离4 min，弃上清；再加400 μL洗液，混匀，分离4 min，弃上清；重复上述步骤再次清洗分离后，将试管直接放入分析仪的测量室，自动泵将激发底物NaOH 和H2O2泵入后发生直接发光反应，同时采用光电倍增管计量光子数量，分析仪自动分析并给出结果。

1.3 观察指标及评价标准

检测灵敏度：采用新型磁分离直接化学发光方法测定20个TSH 质量浓度为0%的标准品，计算平均值和标准差，代入拟合方程再计算相应质量浓度。

精密度：以变异系数（CV）表示，分别检测并计算高、中、低TSH 标准液批间CV（n=20）和批内CV（n=20），批内CV 与批间CV 应分别控制在5%、10%以内。

稀释回收率：将三份不同浓度的TSH 标准液用零标准液分别进行2、4、8倍稀释，测其稀释回收率。

1.4 临床符合性评价

将标本从-20℃冰箱取出，恢复至室温，检测之前置振荡器混匀。分别用新型磁分离直接化学发光方法和ADVIA Centaur 的直接化学发光法对收集的共359份血清进行检测，根据新型磁分离直接化学发光方法和ADVIA Centaur 的直接化学发光法检测结果建立相关方程Y=aX+b，并计算相关系数（R）。R值愈接近于1，表明线性关系愈好。

临床符合率：以TSH 参考范围为标准，采用新型磁分离直接化学发光检测甲亢组、甲减组及对照组的血清标本，分析结果符合性。

1.5 统计学方法

采用Excel 和SPSS 23.0 软件进行数据处理与统计学分析。精密度分析采用均数±标准差（±s）、CV 表示，稀释回收率以测定结果与期望值的比值来表示，与ADVIA Centaur XP 检测结果的相关性分析，采用R 表示。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新型磁分离直接化学发光方法的建立

优化建立了发光标志物不易水解的新型磁分离直接化学发光方法，该方法中抗体的载体及抗原-抗体免疫复合物的分离试剂均应用了新型纳米免疫磁珠，极大地缩短了免疫反应时间。本研究应用该法以临床检测指标TSH 为例进行检测，结果显示出较高的精密度与临床相符性，具体检测过程见下文。

2.2 新型磁分离直接化学发光方法检测指标的确定

2.2.1 检测灵敏度

用零浓度校准品重复测定20次，计算出检测灵敏度为0.01 μIU/mL。

2.2.2 精密度

2.2.2.1 批内精密度 分别采用低、中、高3个浓度的标准液评估新型磁分离直接化学发光方法的批内精密度，一次运行重复检测20次，批内CV≤5%。

表1 批内CV

2.2.2.2 批间精密度 取3个批号的TSH 直接化学发光检测试剂分别检测低、中、高3个不同浓度的TSH标准液，各重复20次，测定并计算60次测量结果的平均值和标准差及CV，批间CV≤5%。2.2.3 稀释回收率

表2 批间CV

将3份不同TSH 浓度（168.42、235.67、452.46μIU/mL）的血清样本用零标准液分别进行2、4、8倍稀释，平均稀释回收率＞80%。

表3 稀释回收率

2.3 临床标本的检测

2.3.1 与ADVIA Centaur XP 检测结果的相关性分析

用本研究建立的新型磁分离直接化学发光方法对359份临床血清样本进行TSH 的定量测定，测定结果与ADVIA Centaur 的直接化学发光法测定结果进行对比分析，相关方程Y=0.9466X+0.7914（R=0.9874，P＜0.001），结果如图1。

图1 新型磁分离直接化学发光方法与ADVIA Centaur 直接化学发光法检测结果的相关性分析

2.3.2 与临床标本的符合率分析

以TSH 参考范围0.40～4.50 μIU/mL 为标准，新型磁分离直接化学发光法检测甲减组患者121例，TSH值结果均较参考范围高；检测104例甲亢患者，TSH值结果均较参考范围低，符合临床诊断；而正常对照组TSH处于正常参考值范围内（表4）。提示用建立的新型磁分离直接化学发光方法检测TSH 所得出的结果有很好的临床相符性。

表4 359例研究对象TSH 检测结果分析（±s）

表4 359例研究对象TSH 检测结果分析（±s）

组别例数 TSH（μIU/mL）甲减组甲亢组正常对照组121 104 134 29.26±18.59 0.06±0.16 2.03±1.25

3 讨论

近年来，化学发光方法不断改进，使用范围逐渐广泛[7-8]。磁分离直接化学发光免疫试验是在酶免疫分析试验、放射免疫实验以及荧光免疫试验等一系列免疫试验之后经过改进发展起来的一种新型标记免疫技术[9]。其弥补了传统免疫检测方法中的技术不足，具有无污染、无放射性、高特异性、高准确度、高灵敏度的优点，是在定量检测肿瘤标志物方面极好的选择[10-11]。此外，磁分离直接化学发光方法在筛查传染病病原体、治疗性药物浓度监测、胎儿产前诊断等方面也有着广泛的作用[12-14]。

本研究成功建立了一种新型磁分离直接化学发光方法，克服了许多传统的免疫检验技术的缺陷，其灵敏度、精密度及临床符合性均可达临床应用要求。该技术最大的特点是采用了异鲁米诺衍生物作标志物、纳米免疫磁性微珠作为分离材料。磁性微珠由于颗粒较小，可以较为均一地分散在溶液中，在这样一个近似液相的环境洪，结合位点较多，其表面反应位点可以充分暴露，从而显著减小抗原与抗体反应的空间位阻，有利于特异性结合，使反应更加彻底，从而极大提高分析方法的选择性[15-16]。异鲁米诺衍生物做为一种发光标志物，被标记到抗原或抗体上时，与蛋白质结合后不易解离，未结合的标志物降解产物易于清除，结合后不影响标志物与蛋白质原有的免疫性，结合物性质稳定、易于保存，因此其发光效率显著增加。磁颗粒分离方式是固相分离方式的一种。纳米免疫磁性微珠可以增大包被面积，缩短免疫反应检测时间，提高检测效率[17-18]。

甲状腺功能异常的发病率逐年上涨，对甲状腺疾病的关注程度日渐增高，甲状腺相关激素在人体的生长、发育、繁殖等生理活动中发挥重要的调节作用[19]。甲状腺功能与成年人的认知功能也有密切相关性，乳腺癌诊断与绝经后甲状腺疾病存在重要关系，因此对甲状腺激素检测结果的准确度和可比性提出了更高的要求。本研究以TSH 的检测为例进行了该技术应用的性能评价。结果显示，本研究建立的新型磁分离直接化学发光方法具有很高的检测灵敏度及精密度，对于低浓度样本仍然具有良好的分辨率且结果可靠，这对于人体超微量TSH 的检测非常关键，刘进等[20]的研究与该结果具有一致性。ADVIA Centaur XP是临床常规应用的仪器，其检测结果基本符合临床，而本实验中应用新型磁分离直接化学发光方法与ADVIA Centaur XP 同时检测临床血清标本，两者结果具有高度相关性，表明本研究建立的新型磁分离直接化学发光方法可以用来精准地定量检测TSH 水平，且检测效果完全达到临床诊断甲状腺疾病的标准。

综上所述，本研究建立的一种新型磁分离直接化学发光方法其灵敏度、精密度及临床符合率均符合临床应用标准，该方法的建立对TSH 等其他激素的检测具有一定应用价值。相信随着对甲状腺激素标准化需求呼声的提高，更高准确度和灵敏度的方法会越来越多地被用于临床疾病诊断中。