响铃草薄层鉴别研究

石洋 王慧娟 彭礼军 郝永佳 张 敏*

1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025

响铃草是云南白族常用的民间药材，为豆科猪屎豆属条叶猪屎豆C.linifoliaL. f. 或假地蓝CrotalariaferrugineaGrah.的根或全草，又名马铃草、狗响铃、响铃子、黄花野百合等[1]。响铃草史载于明代《滇南本草》，其味苦、微酸，性寒，具有补脾肾、敛肺气、利水、解毒之功效。主要用于久咳痰血、耳鸣耳聋、头晕目眩、梦遗、慢性肾炎、膀胱炎、肾结石、扁桃体炎、淋巴腺炎、恶疮、月经不调等[2]。

响铃草的主要化学成分为黄酮、生物碱、香豆素、有机酸和甾醇等，其中黄酮类物质芹菜素、金合欢素、染料木素和山柰素通常作为评价该药材质量的重要指标[3-5]。目前，从响铃草质量标准中关于黄酮类物质薄层色谱鉴别的研究中发现仅存在对染料木素的鉴别，尚未见对于其他黄酮类成分的薄层鉴别报道。因此，本文以云南省景谷县威远镇产响铃草为研究对象，对其进行薄层鉴别方法研究，建立响铃草的薄层鉴别方法，为响铃草的质量标准建立提供支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器 DK-98型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；HZY-A200型电子分析天平(福州华志科学仪器有限公司)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；QY-20三用紫外分析仪(上海奥瑞德精密仪器有限公司)；DGG-9246A电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；FW-400A倾斜式高速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)。

1.2 试药 对照品芹菜素(Q-002-180131)、金合欢素(J-066-180517)、染料木素(R-001-181216)和山柰素(S-004-180911)，均购于成都瑞芬思生物科技有限公司；9批响铃草药材样品购于药材市场，分别产于四川、青川、四川成都、云南省景谷县威远镇、广西、贵州省安顺、福建、云南、贵州，经贵阳中医药大学魏升华教授鉴定为豆科植物假地蓝CrotalariaferrugineaGrah.的根或全草。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 参照文献总黄酮的提取方法[6]: 称取样品粉末用95%乙醇1∶10倍量水浴回流提取2 h，过滤；再用95%乙醇1∶6倍量水浴回流提取2次，每次1.5 h；合并3次滤液，水浴减压回收至无醇味，稠膏趁热用5%碳酸钠溶液溶解，过滤；再用浓盐酸调pH=2～3，过滤，将沉淀干燥即得黄酮粗品。考虑到提取时间较长，故将提取时间减为2 h，其余条件不变，与提取时间为5 h对比，发现不同的提取时间对供试液展开效果影响不大，考虑到节省时间，故将提取时间定为2 h。另外，还考察了不同碱性处理和酸性条件对供试液的影响，结果发现原条件5%的碳酸钠溶液和pH=2～3处理的供试液展开效果最优。

响铃草供试品溶液的制备方法：称取样品粉末2 g，加乙醇20 mL，回流提取2 h，过滤，减压蒸至无醇味，稠膏趁热用5%碳酸钠溶液溶解，过滤，再用浓盐酸调pH=2～3，静置沉淀；然后用乙酸乙酯萃取两次，最后用0.5 mL乙酸乙酯溶解得供试品溶液。

2.2 薄层色谱展开条件考察 按2.1下供试品溶液的制备方法制备响铃草供试品溶液，取适量供试品溶液点于硅胶GF254薄层板上，分别在下展开系统中展开：①乙酸乙酯-三氯甲烷-水(4∶9∶1)；②环己烷-乙酸乙酯-水(5∶4∶1)；③乙酸乙酯-氯仿-环己烷-水(4∶3∶2∶1)，展开后，取出晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。结果见图1，在展开系统②环己烷∶乙酸乙酯∶水=5∶4∶1条件下，色谱图斑点清晰，分离效果最好。在此基础上，将各组成分间的比例进行微调，考察不同的展开剂比例对分离效果的影响(图2～4)，最终确定了响铃草供试品TLC展开剂为环己烷-乙酸乙酯-水(8∶5∶1)。

图1 不同展开系统薄层色谱图

图2 不同环己烷比例薄层色谱图

图3 不同乙酸乙酯比例薄层色谱图

图4 不同薄层色谱图

2.3 薄层色谱鉴别 按2.1下供试品溶液的制备方法制备响铃草供试品溶，取适量供试品溶液与对照品溶液山柰素(0.5 mg/mL)、金合欢素(0.5 mg/mL)、染料木素(0.25 mg/mL)和芹菜素(0.5 mg/mL)点于硅胶GF254薄层板上，以环己烷∶乙酸乙酯∶水=8∶5∶1为展开剂，展开后，取出晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。结果如图7所示，响铃草中黄酮类成分在紫外光254 nm下与山柰萘素、金合欢素和染料木素在相对应的位置显相同颜色斑点。

2.4 方法耐用性考察

2.4.1 重复性考察 分别称取三份响铃草粉末，按2. 1下方法制备成三份平行供试液。将三份供试液点于同一薄层层析板上，以环己烷∶乙酸乙酯∶水=8∶5∶1为展开剂，展开后，取出晾干，置紫外灯(254 nm)下检视，结果显示重复性较好。

图5 响铃草的薄层色谱图

2.4.2 不同薄层板分离效果考察 取供试品和对照品溶液分别点于青岛海洋化工厂、烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂以及自制的硅胶薄层板上。除自制硅胶板分离效果稍差外，商品化的预制板均具有良好的分离效果。

2.4.3 不同温度对分离效果影响的考察 将供试品和对照品溶液点于硅胶薄层板上，分别在4 ℃、室温(28 ℃)以及37 ℃的环境下展开。结果表明在上述条件下都能较好分离，斑点清晰，未有明显差异。

2.4.4 不同湿度对分离效果影响的考察 将供试品和对照品溶液点于硅胶薄层板上，在室温下，相对湿度分别为18%、32%、58%、72%、88%下展开。结果显示，在18%～88%相对湿度条件下分离结果相似，不同湿度对响铃草的薄层鉴别没有影响。

2.5 不同批次响铃草薄层色谱 将产地分别为贵州、云南景谷县威远镇、四川、四川成都、广西、贵州安顺、福建、云南以及青川共九个不同批次的响铃草药材制备成相对应的的供试品溶液，将其与对照品溶液点于同一薄层板上，以环己烷∶乙酸乙酯∶水=8∶5∶1为展开剂，展开后，取出晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视，结果如图6所示。

图6 不同批次响铃草薄层色谱图

9批响铃草药材中以云南景谷县威远镇所产响铃草的展开斑点较为清晰明显，故而将其作为对照药材。不同产地的响铃草中各黄酮类成分稍有不同，含量也有一定差异，但9批响铃草的薄层色谱图中除了来自福建的斑点很不清晰外，均可见与染料木素、金合欢素以及山柰素在其相对应位置显相同斑点。部分批次供试品与芹菜素在相同位置显相同颜色斑点。

3 讨论

黄酮类化合物是响铃草的主要活性成分之一，其中金合欢素、染料木素和山柰素等具有多种药理作用，通常是评价该药材质量的重要指标。本实验研究了响铃草中黄酮类成分薄层色谱鉴别，主要包括对供试品溶液的制备方法以及TLC展开条件的考察，为响铃草药材建立安全、易操作、专属性强的薄层色谱鉴别方法。同时，本实验从响铃草药材中同时鉴别出染料木素、金合欢素以及山奈素，进一步为评价响铃草的质量和响铃草资源的开发利用提供参考，也为完善响铃草药材薄层鉴别方法以及全面评价响铃草药材提供实验资料和科学依据。