具有抑菌活性植物乳杆菌的筛选及抑菌物质的特性分析

孙小涵，孙洪浩，陈秀秀，吕福军

（辽宁波尔莱特农牧实业有限公司，辽宁 沈阳 110127）

近年来，由于在食品和饲料中使用化学添加剂的情况越来越多，给消费者带来的危害越来越大，因此人们对不含化学防腐剂的天然新鲜食品需求越来越高。乳酸菌具有良好的安全性和抗菌活性，在食品和饲料中得到了广泛的应用，是公认的食品级安全微生物。在乳酸菌中，最大的类群是乳杆菌属，它有150多个不同的物种[1]，其中包括一些对宿主健康有益的乳杆菌属[2]。例如，植物乳杆菌是一种重要的工业微生物，其分布广泛，包括乳制品和发酵食品，牛粪、青贮饲料和污水等环境，以及人和动物口腔、肠道和粪便等。

在以往研究中乳杆菌的抗菌物质主要是有机酸[3]、脂肪酸[4]、短肽[5-6]等物质。据报道，乳酸菌能产生6种有机酸，可抑制霉菌的生长，包括乳酸、乙酸和丙酸等[7]。后来，许多研究发现脂肪酸也具有抗菌特性，如植物乳杆菌MILAB14中的3-羟基脂肪酸[8]。副酸杆菌所产生的细菌素对丙酸杆菌有明显的抑制作用[9]。

乳酸菌的抗菌机制很复杂。一些研究人员指出，发酵过程产生的有机酸可以通过进入细胞质来降低细胞内的pH，从而影响致病菌的生长和代谢[10]。此外，有研究人员还认为有机酸可以与某些成分结合，如细胞膜上的脂多糖，从而破坏细胞膜的稳定性，达到抑菌作用[11]。Strom等[12]还发现苯乳酸能抑制丝状真菌的蛋白表达。Bergsson等[13]证实脂肪酸能穿透致病细胞并与其质膜结合，进而改变膜的通透性，达到抑菌作用。Khalaf等[14]发现从乳酸菌中分离出的细菌素也能够通过破坏病原体外膜的完整性而起抗菌作用。

植物乳杆菌具有重要的抗菌活性和益生菌特性，已被用于开发功能性食品并大规模生产，但存在抑菌效率低、抑菌谱窄、抑菌活性不稳定等问题，因此筛选优良的菌株，包括菌株的抗菌物质特性，都是值得我们去发现。本研究拟从猪肠道中筛选出对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用的菌株，并对其抑菌物质展开初步分析，以进一步提供优良的菌种资源，为抑菌物质的开发应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2019年12月至2020年7月在辽宁波尔莱特农牧实业有限公司肽制剂研发中心进行。

1.2 材料

金黄色葡萄球菌（SA）、大肠埃希氏菌（K88）由本实验室保存；植物乳杆菌由本实验室分离得到并保存；MRS肉汤培养基、LB肉汤培养基、琼脂购自北京陆桥技术股份有限公司。过氧化氢酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K购自上海源叶生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳杆菌发酵上清液的制备 首先将保藏的菌种复苏、传代，后按2%的接种量接入50 mL的MRS肉汤培养基，培养48 h，细菌培养液10 000 r/min离心5 min，取上清液，用0.22 μm滤器过滤，备用。

1.3.2 指示菌菌悬液的制备 把大肠杆菌和金黄色葡萄球菌按2%接种量接入LB肉汤培养基中，37 ℃、200 r/min摇床震荡培养16～18 h。

1.3.3 植物乳杆菌抑菌能力的筛选 采用牛津杯平板法测定发酵上清液抑菌活性。首先，加入已经高压灭菌的LB琼脂培养基于平板中，静止放置待培养基凝固后，将指示菌菌悬液（108cfu/mL）均匀地涂在LB琼脂培养基上，将牛津杯置于平板上，每个牛津杯中加入200 μL已制备好的发酵上清液，于4 ℃冰箱中扩散4 h，37 ℃培养16～18h后，测量抑菌圈直径大小，以未接种的MRS肉汤培养基上清液作为空白对照，做3次重复。测量抑菌圈直径，评估抗菌活性。

1.3.4 不同发酵时间上清液的抑菌活性研究 植物乳杆菌LP-01按照2%的接种量转接100 mL的MRS肉汤培养基中，37 ℃、200 r/min摇床震荡培养48 h，分别在0、4、8、12、16、20、24、32、40、48 h取发酵液，测定其OD600值；用牛津杯法测定发酵上清液在每个时间段对指示菌的抑菌活性。

1.3.5 过氧化氢抑菌作用的消除 在发酵上清液中加入1.5 mg/mL的过氧化氢酶，对照组不用过氧化氢酶处理，在37 ℃水浴作用2 h，排除发酵液中过氧化氢的作用，用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，牛津杯平板法进行抑菌能力测定。

1.3.6 pH对抑菌物质的影响 在发酵上清液中起到抑菌作用的可能是细菌素，或是有机酸等物质。为排除酸性物质的干扰，用2 mol/L的氢氧化钠将发酵上清液调至pH 7.0，用牛津杯平板法进行抑菌试验，未被碱中和的发酵上清液做对照，比较处理前后抑菌圈的变化。

1.3.7 温度对发酵上清液抑菌性能的影响 将发酵上清液分别于65、85和100 ℃水浴20 min，对照组为无高温处理的发酵上清液原液，用牛津杯平板法比较处理前后抑菌能力的变化。具体方法参照1.3.3。

1.3.8 蛋白酶对发酵上清液抑菌性能的影响 将发酵上清液分别用胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K在各自最适宜的温度和pH下作用2 h，酶浓度为2.5 mg/mL，再将发酵上清液pH调回至初始值，空白对照组不加酶并用相同条件处理发酵上清液，用指示菌进行抑菌能力的测定。牛津杯法比较处理前后抑菌能力的变化。

2 结果

2.1 不同植物乳杆菌的抗菌活性比较

用牛津杯方法测定5种植物乳杆菌的抗菌能力，结果表明，5种植物乳杆菌对指示菌均具有良好的抗菌活性。如表1所示，根据各菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用，LP-01具有最高的抗菌活性，抑菌圈直径分别为18.08 mm和18.93 mm。因此，选择此菌进行下一步试验。

表1 指示菌抑菌圈直径的测定结果 mm

2.2 不同发酵时间抑菌活性比较

由图1可知，植物乳杆菌LP-01从2 h进入对数生长期，16～20 h后开始趋于平稳生长。发酵上清液在初始阶段（0～4 h）没有明显的抑菌活性，从8 h开始明显改善，抑菌活性随着时间增加逐渐增强。到20 h抑菌活性趋于稳定，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌指示菌抑菌圈直径分别达到18.73 mm和19.32 mm。同时，从图1可直观地看出表明发酵上清液的抗菌作用与细菌的生长情况呈正相关。

2.3 温度、pH、酶对植物乳杆菌LP-01抑菌活性的影响

以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌株，测定了pH、温度和酶对LP-01发酵上清液抑菌活性的影响，其抑菌效果如表2所示。结果表明，在100 ℃处理20 min后，发酵上清液抑菌活性无显著变化，说明抑菌物质具有很好的耐热性；当发酵液pH为7.0时，抑菌活性彻底丧失，表明抑菌物质只有在酸性条件下才有良好的抑菌作用；同时，用过氧化氢酶、胃蛋白酶，胰蛋白酶，蛋白酶K处理的发酵上清液与对照组相比没有出现明显差异（P＞0.05），对发酵上清液抑菌活性影响不大，表明LP-01发酵过程中没有产生过氧化氢，且发酵上清液中的蛋白质没有抑菌作用，说明抑菌物质对消化液蛋白酶不敏感。

表2 不同条件处理下LP-01的抑菌圈直径 mm

3 讨论

在本研究中，笔者比较了几种植物乳杆菌的抗菌活性，发现植物乳杆菌LP-01具有优良的抗菌活性，可有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。笔者对LP-01发酵上清液的抗菌物质特性进行了研究，发现该抗菌物质在酸性条件下具有良好的热稳定性和抗菌活性，在碱性条件下失去抗菌活性，表明发酵上清液中含有具有热稳定的有机酸类物质。此外，经过蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，抗菌活性无明显变化，表明蛋白质在LP-01发酵上清液中的抗菌作用有限。

乳酸菌的抑菌作用涉及各种代谢物。例如，乳酸菌产生的乙酸和丁酸对霉菌有抑制作用[15-16]；Guo等[17]从植物乳杆菌IMAU10014中提取的苯乳酸具有抑菌作用；有研究者从植物乳杆菌中分离出了其他抗菌物质如3-羟基癸酸和癸酸，对真菌具有良好的抗菌活性。此外，Atanasova等[18-19]还发现在发酵过程中代谢产生的过氧化氢和其他物质也显示出了抗菌活性。为此，许多研究者对代谢物中的抗菌机制进行了广泛的研究。共同的研究机制是有机酸可抑制细菌细胞膜的稳定性或降低细胞内的pH，从而影响致病菌的代谢，起到抑制作用。而细菌素是通过增加细胞膜的通透性，引起细胞内各离子的渗漏和能量的消耗，最终导致细菌死亡。

综上所述，乳酸菌的抑菌作用与其代谢产物密切相关，不同乳酸菌的代谢产物不同。笔者通过试验探究乳酸菌的抑菌物质，发现LP-01上清液的主要抗菌物质为含有热稳定的有机酸，有机酸通过破坏了细菌的细胞膜结构，导致细菌不能正常生长和繁殖，从而导致细菌死亡，发挥其抑菌作用。其抑菌物质及机制还需要进一步地研究加以佐证。