磨玻璃结节样肺腺癌MSCT征象与Ki67、PKM2、SPINK1蛋白表达的相关性研究

郑宵阳, 王余广, 李博, 刘睿楠, 李峥, 万静茹, 王东旭, 张天宇, 丛厚义

肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤，在我国的发病率和死亡率也居高不下，早发现、早诊断和早治疗至关重要。近年来，随着人们对健康的重视程度不断增高及影像技术的发展，越来越多的肺磨玻璃结节(ground-glass opacity nodules，GGO-nodules)被检出[1,2]。GGO结节术后病理多为腺癌，并遵守一种循序渐进的恶变发展方式[3]。近年来随着分子生物学的迅猛发展，许多与肺腺癌病理和预后有关的分子标志物成为众多学者研究的重点，如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)[4]、Ki67[5]、蛋白酪氨酸磷酸酶PKM2蛋白[6]及丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 1型 ( serine protease inhibitor Kazal 1，SPINK1)[7]等。通过研究这些分子标志物的表达水平，可以帮助判断患者预后和制定临床治疗方案。然而，目前这些分子标志物的检测都是有创性的，需通过获得活体组织标本，结合病理诊断结果才能完成。因此，非侵袭性预测这些分子标志物的表达对肺腺癌的精准诊疗具有重要意义，尤其是对于那些有临床特征但不能接受有创性检查的患者。影像检查具有方便、快速、无创等优点[8]。已有多篇研究报道MSCT征象对预测GGO结节肺腺癌患者的EFGR突变具有一定意义[9-11]，然而在预测Ki67、PKM2、SPINK1这些重要分子标志物上还较少有研究报道。因此，本研究旨在通过探讨GGO结节肺腺癌的MSCT征象与Ki67、PKM2、SPINK1表达间的相关性，以期为术前无创性评估肺腺癌预后以及疾病的临床诊治提供参考。

材料与方法

1.病例资料

搜集2018年9月-2020年6月于本院行手术治疗的肺腺癌患者。病例纳入标准：①经病理诊断为肺腺癌；②术前行MSCT平扫，影像表现为磨玻璃结节；③术前未行放、化疗等前期辅助治疗；④无纵隔淋巴结转移及远处器官转移；⑤临床、病理及影像学资料完整。病例排除标准：①存在肺炎等其他肺部疾病或肺部先天性疾病；②患有其他部位恶性肿瘤；③有胸廓手术史；④合并心、脑、肝、肾疾病或其他全身性疾病。最终纳入80例患者，其中男58例，女22例，年龄47～78岁，平均(57.60±8.27)岁。本研究获本院医院伦理委员会批准，所有患者均自愿加入本研究，并签署了知情同意书。

2.检查方法

MSCT检查采用东芝aquillon 64排128层螺旋CT，胸部CT扫描范围为肺尖至膈底，扫描参数：管电流100～200 mA，管电压120 kV，矩阵512×512，螺距1.2，重建层厚1.0 mm，层间距0.5 mm，数据传输至PACS系统及后处理工作站进行重建。扫描前训练患者憋气，嘱患者扫描时吸一口气憋住，避免呼吸运动造成的伪影对位于肺底的结节评估产生影响。应用西门子三维后处理软件MM Reading及分析软件Oncology处理发现的结节，进行图像重建，测量并记录结节大小、实性部分最大径、类型(单纯性GGN、混合性GGN)、个数(单发、多发)、形态、边缘及内部结构特征(包括分叶、毛刺、血管集束、空泡、胸膜凹陷、充气支气管征)。由2位经验丰富的放射诊断医师共同阅片，结果有分歧时通过协商达成一致。

3.免疫组织化学方法及判定标准

取术后病理组织标本，采用免疫组织化学检测Ki67、PKM2、SPINK1蛋白表达水平，试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。Ki-67表达判定标准：主要定位于细胞核，呈棕黄色，染色程度越深得分越高，无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；染色细胞所占比例越高得分越高，阴性为0分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。最后将染色程度分值与染色细胞比例分值相乘得到最终分值，<3分为低表达，≥3分为高表达。PKM2表达判定标准：主要定位于细胞质，呈棕黄色，染色程度计分中无染色为0分，弱染色(浅黄色)为1分，中度染色(黄棕色)为2分，强染色(棕色)为3分；染色细胞所占比例计分中未见阳性细胞为0分，<25%为1分，25～50%为2分，50～75%为3分，>75%为4分；染色指数=染色强度×阳性细胞比例，以染色指数中位数(8分)为分界点，<8分为PKM2无表达或低表达，≥8分为PKM2高表达。SPINK1表达判定标准：主要定位于细胞质，呈棕黄色，染色程度越深得分越高，无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；染色细胞所占比例越高得分越高，阴性为 0 分，1%～10% 为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。以染色强度得分和细胞比例得分的乘积为判断标准，<3分为低表达，≥3分为高表达。

图1 浸润性腺癌患者，男，49岁，Ki67高表达，MSCT示左肺上叶结节(箭)分叶征。 图2 微浸润性腺癌患者，女，46岁，Ki67高表达，MSCT示右肺下叶结节(箭)分叶征。 图3 浸润性腺癌患者，女，53岁，PKM2高表达，MSCT示右肺下叶不规则结节(箭)、分叶征和胸膜凹陷征。 图4 浸润性腺癌患者，男，50岁，PKM2高表达，MSCT示右肺上叶不规则结节(箭)、分叶征和胸膜凹陷征。 图5 微浸润性腺癌患者，男，50岁，SPINK1高表达，MSCT示右肺上叶混合性GGN(箭)、分叶征和胸膜凹陷征。 图6 浸润性腺癌患者，女，54岁，SPINK1高表达，MSCT示右肺上叶混合性GGN(箭)、分叶征和胸膜凹陷征。

4.统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。定量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；定性资料以频数和百分比表示，组间比较采用χ2检验。对单因素分析结果中有意义的因素进行二元Logistic分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.病理及免疫组化结果

80例肺腺癌患者中，浸润性腺癌52例，微浸润腺癌13例，原位腺癌5例。肿瘤直径0.6～3.1 cm，平均(1.69±0.42) cm。Ki67高表达46例(57.5%)，低表达34例(42.5%)；PMK2高表达42例(52.5%)，低表达38例(47.5%)；SPINK1阳性45例(56.3%)，阴性35例(43.7%)。

2.Ki67、PKM2、SPINK1蛋白表达水平与MSCT征象间的关系

Ki67的表达水平与MSCT征象中的结节单发或多发、有无分叶征有关，Ki67高表达患者中出现多发结节、分叶征的比例显著高于低表达者，差异有统计学意义(P<0.05)，而其他MSCT征象与Ki67的表达水平均无统计学相关性(P>0.05，表1，图1、2)。

表1 Ki67蛋白表达水平与MSCT征象间的关系

PKM2的表达水平与MSCT征象中的形态、有无分叶征、胸膜凹陷征及实性部分最大径有关，PKM2高表达患者中出现不规则形结节、分叶征和胸膜凹陷征的比例均显著高于低表达者，差异有统计学意义(P<0.05)，并且前者的实性部分最大径显著高于后者，差异亦有统计学意义(P<0.05)，而其他MSCT征象与PKM2的表达水平均统计学相关性(P>0.05，表2，图3、4)。

表2 PMK2蛋白表达水平与MSCT征象间的关系

SPINK1的表达水平与MSCT征象中的结节类型、有无分叶征和胸膜凹陷征有关，SPINK1高表达患者中出现混合性GGN、分叶征和胸膜凹陷征的比例均显著高于低表达者，差异有统计学意义(P<0.05)，而其他MSCT征象与SPINK1的表达水平均无统计学相关性(P>0.05，表3，图5、6)。

表3 SPINK1蛋白表达水平与MSCT征象间的关系

3.二元Logistic回归分析

对单因素分析中的变量赋值(表4)，分别以Ki67、PKM2、SPINK1表达水平为因变量(低表达=0；高表达=1)，以各自单因素分析结果中有统计学意义的变量作为自变量，进行二元Logistic分析。Logistic分析结果显示，MSCT征象中出现分叶征是肺腺癌Ki67高表达的独立危险因素(P<0.05)，出现分叶征和胸膜凹陷征是PKM2高表达的独立危险因素(P<0.05)，出现分叶征和胸膜凹陷征是肺腺癌PKM2高表达的独立危险因素(P<0.05，表5)。

表4 MSCT征象各变量的赋值

表5 Logistic回归分析结果

讨 论

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，已成为癌症死亡的主要原因，非小细胞肺癌约占全部肺癌的80%，而肺腺癌是非小细胞肺癌中最常见的组织学亚型。由于肺腺癌的发生、发展机制十分复杂，并且尚不明确，近年来随着分子生物学的发展，许多学者致力于对肺腺癌病理和预后分子标志物进行研究，以期找到肺腺癌分子靶向治疗的突破点。Ki67是一种与增殖细胞有关的核抗原，对判断肿瘤的恶性程度及侵袭力有一定意义。最近的一项研究结果显示，随着肺腺癌患者Ki67表达水平增高，患者的复发率增高，总生存率降低，并且预后不良[12]，所以研究者认为Ki67蛋白高表达肺腺癌患者术后应尽可能予以积极治疗。PKM2是一种代谢酶，可激活糖酵解和脂质合成，并且PKM2还可在癌症的发生和进展中作为信号调节因子。相关研究显示PKM2在肺腺癌组织中表达增高，下调PKM2的表达可抑制肺腺癌的肿瘤生长和侵袭，并且PKM2的高表达与患者预后不良有关[13]。SPINK1的主要生理作用是抑制胰蛋白酶原等多种丝氨酸蛋白酶原活性，拮抗胰腺等组织的“自身消化”；相关研究表明，SPINK1与表皮细胞生长因子结构相似，可通过自分泌形式激活表皮细胞生长因子信号传导通路，从而促进细胞增殖[14]。相关研究结果表明，SPINK1可促进人肺腺癌细胞的增殖，并且SPINK1表达升高提示患者预后不良[7,14]。因此，这些分子标志物都是与肺腺癌预后有关的分子标志物，而通过探讨GGO结节肺腺癌的MSCT征象与Ki67、PKM2、SPINK1表达之间的相关性，可为术前无创性评估肺腺癌预后提供一定参考依据。

本研究单因素分析结果显示，Ki67的表达水平与MSCT征象中的结节单发或多发、有无分叶征有关，PKM2的表达水平与MSCT征象中的形态、有无分叶征、胸膜凹陷征及实性部分最大径有关，SPINK1的表达水平与MSCT征象中的结节类型、有无分叶征和胸膜凹陷征有关。进一步的多因素分析结果表明出现分叶征是肺腺癌Ki67高表达的独立危险因素，出现分叶征和胸膜凹陷征是PKM2高表达的独立危险因素，出现分叶征和混合性GGO结节是肺腺癌PKM2高表达的独立危险因素。以上结果提示，分叶征和胸膜凹陷征的出现对判断肺腺癌预后分子标志物的表达水平至关重要。

分叶是指肿块的轮廓表面通常呈现起伏不平的多个弧形，而并非呈现规则的圆形或椭圆形，形似多个融合在一起的结节。分叶征出现的病理学基础包括以下几个方面：肺的结缔组织间隔、进入肿瘤的血管或支气管分支、从肿瘤内向外生长的血管和结缔组织等引起肿瘤生长受限；肿瘤边缘各部位肿瘤细胞的分化程度不一，生长速度不同；肿瘤内部纤维组织的收缩[15]。相关研究表明，恶性GGO结节更容易出现分叶征，而恶性程度高的肿瘤往往也预后较差[16,17]。胸膜凹陷征的主要病理基础是瘤内纤维化，而纤维母细胞在肿瘤血管形成中扮演至关重要的角色。新发肿瘤病灶内的血管结构相对而言缺乏完整性，且血管内皮的间隙较大，因此更容易使血液中的纤维蛋白原渗入组织间隙，从而生成纤维母细胞；此外，恶性肿瘤细胞增殖旺盛，组织内缺氧会导致肿瘤病灶产生纤维化收缩，从而使得胸膜凹陷征的发生概率进一步增高[18]。相关研究表明，胸膜凹陷征也是良恶性GGO结节鉴别的一个重要征象，在恶性GGO结节中胸膜凹陷征的出现比例显著增高[18]。因此，分叶征和胸膜凹陷征在一定程度上反映了肺腺癌的不良预后，是预后的重要预测因素。然而，本研究也存在一些局限性，本研究样本量不大，这可能会对结果的稳健性产生一定影响，在未来有条件的情况下，我们会纳入更多患者，以得到更准确的研究结果。

综上所述，MSCT征象中的分叶征和胸膜凹陷征有助于预测磨玻璃结节样肺腺癌Ki67、PKM2、SPINK1的表达状态，从而为疾病的预后评估和临床诊治提供参考依据。