PCOS患者外泌体中差异表达的蛋白质和遗传物质及其作用机制研究进展

张建馨，王晓彤，李洋，臧怡平，于竟，杜伯涛

(哈尔滨医科大学附属第二医院生殖中心，哈尔滨 150086)

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期妇女最常见的内分泌疾病，患病率约为10%～20%[1]，以多囊卵巢、高雄激素血症、胰岛素抵抗(IR)和稀发性排卵为主要临床表现，易并发肥胖、2型糖尿病(T2DM)、心血管疾病(CVD)和子宫内膜癌等疾病。PCOS的发病机制尚不完全清楚，环境和遗传因素被认为是PCOS发生的潜在原因。

近年来多项研究表明，外泌体存在于PCOS患者卵泡液和血液中，并可通过传递多种蛋白质、miRNAs、lncRNAs和circRNAs等调节细胞生理功能。本文就PCOS患者外泌体中差异表达的蛋白质及遗传物质等及其相关作用机制做一综述。

一、外泌体概述

外泌体是由细胞分泌的直径为40 nm～150 nm的细胞外囊泡[2]。外泌体在生理和病理条件下均可由几乎所有类型的细胞产生，并通过体液(例如血液、唾液、母乳等)广泛分布[3]。外泌体通过细胞内多囊泡的内陷形成，然后融合到质膜上，最后释放到细胞外。它通常在生理条件下由内质网的囊泡结构通过质膜释放以对附近的细胞发挥调节功能[4]。外泌体是细胞信号传递的重要媒介，可以保护信号通路不被中断[5]。外泌体中含有细胞特异的各种蛋白质、miRNAs、lncRNAs和circRNAs等，并通过体液到达远端的组织和器官，释放携带的因子，调节细胞生理功能，它们可以反映来源细胞的病理和生理状态。

二、PCOS外泌体中相关蛋白质

目前，关于人卵泡液中外泌体的蛋白质组学分析已有一些研究，但是与PCOS发生机制相关性的报道很少。Li等[7]通过比较PCOS和健康女性卵泡液中外泌体的蛋白质组学特征，发现两组均含有S100-A9蛋白，而PCOS患者中的S100-A9蛋白表达量更高；除此之外，富含S100-A9的外泌体可以显著上调卵泡液中几种促炎因子和趋化因子的表达，如IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α等，而上述炎症介质的过表达正反馈增强S100-A9的表达。

S100-A9属于25个同源的低分子量细胞内钙结合蛋白家族，主要由活化的粒细胞释放，通过与细胞表面受体结合触发参与炎症反应的信号通路，并在细胞增殖、分化和迁移等过程中发挥重要作用[8]。富含S100-A9的外泌体能够激活颗粒细胞中NF-κB信号通路，促进炎症反应并破坏类固醇生成。研究表明，PCOS是一种炎症状态，可以使卵泡液和血浆中炎症标志物水平增加，巨噬细胞/单核细胞募集增强，卵巢局部炎症加重。而NF-κB是炎症调控的重要转录因子，且在PCOS合并IR的患者中血清NF-κB明显高于正常对照组患者[9]。CYP17是雄激素代谢途径中的关键酶，CYP17的活性增强可以促进PCOS患者中雄激素的生物合成和分泌。外泌体富集的S100-A9通过NF-κB通路显著上调CYP17 mRNA的表达，从而干扰了类固醇生成。表明外泌体中的S100-A9主要通过NF-κB途径干扰了几种基因的表达和激素信号传导，这可能与PCOS的发生机制有关。

三、PCOS外泌体中相关遗传物质

1.miRNAs：微小RNA(miRNAs)是由20～25个核苷酸组成的一种短链非编码RNA(ncRNA)分子，可通过抑制翻译或结合靶标mRNA的3′非翻译区(3′-UTR)诱导转录产物的降解而发挥基因表达调控作用[10]。越来越多的研究表明，miRNAs可以调控细胞生长发育、凋亡、代谢、应激反应和造血分化等多种关键的生物学功能。此外，循环中异常表达的miRNAs 还与PCOS、子宫内膜异位症、糖尿病等相关。然而我们对miRNAs与PCOS之间的确切关系的认识仍是初步的，miRNAs在PCOS的诊断和治疗中的潜在作用还有待明确。近年来，越来越多的研究发现，PCOS患者外泌体中存在差异表达的miRNAs，而由外泌体相关miRNAs介导的细胞间信号传递新机制引起了广泛关注。

1.1 miR-320：刘凯鲁等[11]和Sang等[12]均发现PCOS患者外泌体中miR-320的表达水平低于对照组。miR-320可靶向调节转录因子E2F1和SF-1的表达，从而抑制颗粒细胞的增殖和雌激素的生成，并促进孕酮的生成[13]。也有研究表明，miR-320a/RUNX2/CYP11A1(CYP19A1)级联反应与PCOS患者中雌激素缺乏症有密切联系，miR-320a的缺乏使RUNX2失调，进而会影响PCOS患者的卵丘颗粒细胞中的类固醇生成[14]。因此，检验患者的miR-320a/RUNX2表达比可能会提供更准确的诊断信息，并可能影响PCOS的推荐治疗方案。除此之外，miR-320还与IR有关。有研究认为，miR-320负调控其靶点基因ET-1表达[15]，通过IRS-1参与调控卵泡成熟的ERK1/2信号通路，进而抑制PCOS患者的IR[16]。

1.2 miR-27a-5p：PCOS患者罹患子宫内膜癌(EC)的风险明显增加，而位于19号染色体上的miR-27a在PCOS患者子宫内膜癌的发病中起着至关重要的作用。Che等[17]研究发现，与正常对照组相比，PCOS患者的血清外泌体中miR-27a-5p含量更高，并证实miR-27a-5p模拟物转染EC细胞系Ishikawa和HEC-1A后，可以通过直接作用于靶向基因SMAD4促进EC细胞的迁移和侵袭。除此之外，也有研究表明，miR-27a-3p在PCOS小鼠模型卵巢中高表达，并通过下调Creb1及其下游Cyp19a1的表达，抑制雄激素向雌激素转化，导致雄激素积累；而雄激素可诱导miR-27a-3p的表达，并通过miR-27a-3p/Creb1/Cyp19a1通路影响颗粒细胞功能，进一步加剧雌激素和雄激素的失衡[18]。

1.3 miR-483-5p：有研究发现，miR-483-5p在PCOS卵泡液外泌体中表达明显下降[19]。而王洁等[20]发现，在PCOS血清外泌体中miR-483-5p的表达明显上升。胰岛素生长因子(IGF1)是miR-483的3p直接靶基因，miR-483-5p通过调控IGF1和PIK3R1激活PI3K/AKT从而降低IR[21]。除此之外，miR-483-5p被发现在PCOS患者的卵丘颗粒细胞中高表达并抑制MAPK3的蛋白表达，从而阻断MAPK信号通路、调控卵丘颗粒细胞的增殖分化[22]。MAPK信号通路是胰岛素信号通路之一，它可以介导有丝分裂，并在调节细胞的增殖、分化、凋亡中发挥关键作用。因此，外泌体中miRNA可能通过影响胰岛素靶细胞的增殖和分化来促进PCOS患者胰岛素抵抗的发生。此外，P38/MAPK蛋白还被发现在卵母细胞表达，外泌体可能通过调节卵母细胞成熟参与PCOS发生发展[23]。

1.4 miR-146-5p：Jiang等[24]发现miR-146a-5p在PCOS患者血清外泌体中表达明显上升。有研究表明，miR-146a变异的女性罹患PCOS的风险更高，这可能与miR-146a的上调有关[25]。miR-146与炎症反应和IR有关，miR-146作为先天免疫反应中的负反馈调节通路的因子，避免机体发生过度的炎症反应；miR-146可以直接抑制TLR下游几个促炎分子的表达，包括IL-1受体相关激酶1(IRAK1)、IL-1受体相关激酶2(IRAK2)和TNF受体相关因子6(TRAF6)等[26]。有实验发现PCOS小鼠模型中miR-146a表达上调，且慢性低度炎症和氧化应激可能是PCOS的主要病因[27]。有实验验证miR-146a的直接靶基因中约有54%与胰岛素敏感性相关，并且发现miR-146a与miR-155正相关[28]。这两种miRNA被认为可能是FoxO1基因调节剂，而FoxO1基因是胰岛素信号级联反应的关键下游介质[29]。因此，外泌体中的miR-146a是否通过miR-146a/FoxO1参与PCOS及IR的发生发展还需进一步探究。除此之外，FoxO1在促进PCOS的卵泡闭锁和GCs凋亡中起着重要作用[30]。

1.5 miR-199：研究发现，卵泡液外泌体中的miR-199 在PCOS组的表达水平低于对照组[11]。然而，与之相反，也有研究显示PCOS患者卵泡液外泌体中的miR-199表达显著上调[19]。Shao等[31]通过双荧光素酶基因测定，鉴定WT1为miR-199a-5p的靶基因，并且抑制miR-199a-5p可导致WT1介导的JAK/STAT3途径的激活，表明miR-199a-5p可能通过WT1介导的JAK/STAT3通路调控PCOS的发生机制。同时，miR-199a-5p可以刺激PCOS卵巢颗粒细胞凋亡。

2.lncRNA：长链非编码RNA(lncRNA)是一种非编码RNA，它的长度超过200个核苷酸。Karreth等[32]提出了一种称为竞争性内源性RNA(ceRNA)的理论，即lncRNA、mRNA和假基因可以竞争性地与microRNA反应元件(MRE)结合并相互作用进而调控基因表达，这提供了一种新的基因调控机制。刘琳等[33]通过高通量测序发现PCOS患者卵泡液外泌体内存在差异表达的 lncRNA，并通过实时定量PCR(RT-qPCR)验证发现PCOS患者卵泡液外泌体中DNMT1、DNMT2、DNMT3A和H19的表达水平显著下降，而SGK1表达水平显著增加。

颗粒细胞(GCs)增殖可能是PCOS发生机制之一，而它的调控途径尚不完全清楚。最新研究发现，lnc-MAP3K13-7：1在PCOS患者的GCs中高表达，伴有DNA低甲基化、DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达降低和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(CDKN1A，p21)表达增加[34]。而依赖DNMT1的CDKN1A启动子低甲基化促进CDKN1A转录，抑制GCs增殖。也有研究发现，高浓度睾酮可以下调DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达，降低PDCD4启动子区的甲基化水平，这可能与雄激素诱导GCs凋亡的机制有关[35]。

Qin等[36]发现lncRNA H19表达水平与PCOS发病风险显著相关，且与空腹血糖水平呈正相关。所以对于易感人群，lncRNA H19可能成为PCOS早期诊断的生物标志物。Sun等[37]通过实验证实了lncRNA H19作为ceRNA在KGN细胞中的作用，其通过lncRNA H19/miR-19b/CTGF调节轴调节CTGF的表达，而异常表达的CTGF可以参与PCOS颗粒细胞增殖和卵巢纤维化过程，最终影响PCOS的发病机制。

3.circRNA：环状RNA(circRNA)是一种稳定的内源性非编码RNA，可以调节基因表达并发挥多种生物学作用。circRNA的特征是共价闭环而无5′或3′极性，特殊的共价闭环结构使其比传统线性RNA更稳定，可长时间抵抗RNase和核酸外切酶的生物学功能。

为了研究circRNA的潜在作用，Wang等[38]以非PCOS样本为对照，对PCOS患者卵泡液外泌体进行了测序，生物信息分析发现，有167个 circRNA表达显著上调和245个 circRNA表达显著下调。PCOS患者中，不同的 circRNA可能与细菌感染、慢性炎症和氧化应激相关的通路有关。除此之外，Huang等[39]通过RNA测序比较了PCOS和对照组患者卵泡液外泌体的circRNA表达谱，发现16个circRNA显示出表达差异，其中hsa_circ_0006877(circLDLR)由低密度脂蛋白受体(LDLR)基因转录加工而成，该基因参与了卵巢类固醇生成；通过cytoscape软件预测了circLDLR-miR-1294-CYP19A1竞争性内源RNA(ceRNA)网络，并通过荧光素酶检测及在PCOS患者卵丘细胞中相关表达得到证实。最终证实外泌体中的circLDLR会增加受体细胞中miR-1294的表达并抑制CYP19A1的表达，并降低其雌激素的分泌，外泌体这可能与PCOS的发生机制有关。

四、总结与展望

近年来，对PCOS的研究主要基于基因改变和表观遗传学等传统领域，而PCOS患者外泌体中差异表达的蛋白质及遗传物质等及其相关作用机制也已引起广泛关注。随着从不同类型的外泌体中分离出各种蛋白质和遗传物质，人们逐渐认识到它们在细胞信号传递和表观遗传调控中的关键作用。重要的是，无论是在病理状态还是生理状态下，外泌体的含量都受到其亲代细胞的精细调节，通过将信息从亲代细胞传递给其他细胞以实现特定功能。反过来，也可以通过分析其外泌体含量来估计亲代细胞的功能状态，这为基于外泌体的诊断奠定了基础。因此，外泌体有望成为一种新型的标志物来评估多囊卵巢的状况，深入研究外泌体的作用和作用机制，尤其是外泌体中各种蛋白质、miRNA、lncRNA和circRNA等，将为治疗多囊卵巢提供新的策略，最终可能为其诊断、治疗和预后提供重大创新。虽然外泌体显示出潜在的重要性和意义，但外泌体应用于临床的可能性还需要更多更有力的证据支持。