控制性超促排卵高雌状态对冷冻胚胎移植周期临床结局的影响

鲁 南，陈 华

(1 南京医科大学第一附属医院生殖中心，南京 210029；2 上海市集爱遗传与不育诊疗中心)

自1978 年世界上首例体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)的婴儿诞生以来，人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)不断发展，为无数自然妊娠困难的夫妇带来了生命的延续。目前全世界已积累了超过700 万与ART 相关的女性及婴儿[1]。但ART 技术可能带来的健康风险不容小觑。大量研究[2]显示，ART技术将增高妊娠风险。与自然妊娠相比，ART 技术孕妇的早产率、低出生体质量儿(low birth weight,LBW)发生率、妊娠期并发症的发生率显著增高。

ART 对母婴及子代健康的确切影响机制目前还在探讨中。在IVF-ET 过程中，为了获得更多的卵子从而获得更多的胚胎，控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH)周期中将应用药物对卵巢进行刺激，从而导致患者血清高雌激素水平。高水平的血清雌激素造成的亚理想种植环境可能会影响妊娠结局，在新鲜移植周期中，人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)日雌二醇(estradiol,E2)＞2 500 pg/mL 是IVF 技术中LBW 发生的独立预测因子[3]。

随着玻璃化冷冻技术的不断发展，越来越多的中心采取冷冻胚胎移植(frozen embryo transfer,FET)，不仅可保存患者多余的胚胎，而且可提供更好的子宫条件以供移植[4]，避免COH 可能导致的不良后果，降低卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulationsyndrome,OHSS)发生率，并使母体环境在妊娠时脱离高雌环境。目前关于COH 导致的高雌环境中获卵获胚是否对FET 周期的妊娠结局鲜有研究。HCG 日血清雌激素水平可能预测FET 周期的临床结局，与新鲜周期类似，当COH 周期中hCG 日E2 水平＞3 000 pg/mL 时，FET 周期中胎儿的出生体质量亦会下降[5]。COH 周期高雌环境获卵，FET 周期正常激素环境移植，先前COH 周期时的高雌状态是否仍对妊娠结局及子代产生影响尚有待研究。

1 资料与方法

1.1 纳入及排除标准 所有于2014 年1 月—2017年12 月期间在上海市集爱遗传与不育诊疗中心进行的FET 周期作为可能的研究对象。纳入标准：(1)女性患者年龄＜38 岁；(2)辅助生育受精方式为IVF或卵胞浆内单精子注射技术(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)；(3)FET 周期内膜准备方式为激素替代周期(hormone replacement therapy,HRT)；(4)COH周期的临床结局为胚胎全冻。排除标准：(1)COH 周期为自然周期者；(2)胚胎移植前基因诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)或胚胎移植前基因筛查(preimplantation genetic screening,PGS)周期；(3)诊断为多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)的患者：PCOS 诊断按2003 年鹿特丹诊断标准[6]；(4)反复种植失败的患者(本中心FET 周期≥3 次者)；(5)供精IVF 及经皮附睾穿刺取精(percutaneous epididymal sperm aspiration,PESAs)/睾丸穿刺取精(testicular sperm aspiration,TESA)周期。

1.2 临床资料的收集 (1)收集纳入周期患者的基本信息，包括年龄、体质量指数(body mass index,BMI)、不孕原因、不孕年限。(2)收集所移植胚胎来自的COH周期治疗信息，包括：促性腺激素(gonadotropins,Gn)用量、Gn 天数、注射hCG 日血清E2 水平、受精方式(IVF/ICSI)、获卵数、受精数、卵裂数、有效胚胎数，计算受精率、卵裂率及有效胚胎率。(3)收集FET 周期的临床信息，包括移植胚胎数、移植日内膜厚度。(4)随访FET 周期的临床结局，包括临床妊娠率、活产率、单胎妊娠率、单胎活产率、双胎妊娠率、宫外孕率、异位妊娠率；随访单胎妊娠患者的妊娠结局，包括分娩孕周、早产率、分娩方式、胎儿出生体质量、LBW 发生情况，并随访单胎妊娠的患者妊娠期高血压病、妊娠期糖尿病的发病情况。

患者在进入本中心COH 周期及FET 周期前按诊疗常规进行治疗，并签署知情同意书。研究通过上海市集爱遗传与不育诊疗中心伦理委员会审批。

1.3 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件进行分析。计量资料以表示，多样本组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两组间比较采用Bonferroni 校正的组间对比；两组对比采用两独立样本t 检验；定性资料用百分率(%)表示，组间率的比较采用χ2检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 分组情况 研究共纳入FET 周期数11 823个，患者8 843 例。FET 周期所移植胚胎来自的COH 周期hCG 注射日E2 峰值水平分布呈偏态分布。将纳入的FET 周期分为E2≤25%百分位数，25%百分位数＜E2≤50%百分位数，50%百分位数＜E2≤75%百分位数以及E2＞75%百分位数4 组。FET 周期按E2峰值分组：A 组，E2≤2 950 pg/mL；B 组，2 950＜E2≤4 240 pg/mL；C 组，4 240＜E2≤5 903 pg/mL；D 组，E2＞5 903 pg/mL。

表1 各组患者一般资料比较(,n)

表1 各组患者一般资料比较(,n)

注：与A 组比较，*P＜0.05；与B 组比较，#P＜0.05；与C 组比较，△P＜0.05。

2.2 一般资料 患者治疗前不孕因素构成差异无统计学意义，输卵管性不孕是本中心患者接受IVF治疗最主要的指征。更高雌激素四分区间中的患者年龄更小，BMI 更小(P＜0.05)，见表1。

2.3 COH 周期临床信息 各组使用Gn 天数差异无统计学意义。然而，hCG 日的E2 越高，使用的Gn总量反而越低，各组间差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。提示hCG 日的高雌状态不一定由卵巢刺激药物导致，可能与患者自身条件相关。各组间ICSI 比例差异无统计学意义(P＞0.05)。

各组COH 周期hCG 日E2 水平与获卵数呈正相关，符合每个成熟卵泡对应E2 200～300 pg/mL 的临床规律。COH 周期中MⅡ卵数(metaphase Ⅱ,成熟卵)、受精数及有效胚胎数均与E2 水平呈正相关。尽管获得的卵子数随着E2 水平提高而增多，4 组间受精率、卵裂率及有效胚胎率差异均无统计学意义(均P＞0.05)，见表2。

表2 移植胚胎来自的COH 周期治疗信息(,n,%)

表2 移植胚胎来自的COH 周期治疗信息(,n,%)

注：与A 组比较，*P＜0.05；与B 组比较，#P＜0.05；与C 组比较，△P＜0.05。

2.4 FET 周期结局 4 组在FET 周期中平均移植胚胎数和移植日的内膜厚度差异均无统计学意义(均P＞0.05)，见表3。随着hCG 日雌激素水平的升高，B、C、D 组妊娠率差异无统计学意义，但显著高于A 组。妊娠率呈先增高后降低的趋势，妊娠率在C 组最高达55.25%，此后又稍下降。当E2≤2 950 pg/mL时，妊娠率明显低于E2＞2 950 pg/mL 者。

同样活产率C 组最高，E2＞2 950/mL 者活产率显著高于E2≤2 950 pg/mL 者，提示COH 周期中，一定水平的高雌状态能获得较好的临床妊娠率及活产率。各组中宫外孕率、流产率、双胎妊娠率差异均无统计学意义(均P＞0.05)(表3)，提示流产、宫外孕及双胎妊娠的发生与COH 的高雌状态无关。

为排除双胎妊娠和其他可能因素对早产、分娩方式、妊娠期并发症、胎儿出生体质量及分娩孕周的影响，对FET 周期获得单胎妊娠者的妊娠结局进行随访统计(表4)。各组FET 周期单胎妊娠者剖宫产率、早产率、分娩孕周、妊娠期高血压病发病率、妊娠期糖尿病发病率差异均无统计学意义(均P＞0.05)，提示hCG 日E2 水平不影响冷冻周期单胎妊娠的分娩方式、早产及妊娠期并发症的发生。

在A、B、C 组中，即在COH 周期中E2 水平≤5 903 pg/mL 时，新生儿出生体质量未见明显差异(P＞0.05)，但当E2 水平上升＞5 903 pg/mL 时，新生儿出生体质量明显降低，与低雌状态相比，新生儿出生体质量减少约100 g(P＜0.05)。

与E2＜5 903 pg/mL 者相比，E2＞5 903 pg/mL时，LBW 发生率明显上升几乎是其2 倍(P＜0.05)。

表3 FET 周期结局(,n,%)

表3 FET 周期结局(,n,%)

注：与A 组比较，*P＜0.05。

表4 FET 周期单胎妊娠临床结局(n,%,)

表4 FET 周期单胎妊娠临床结局(n,%,)

注：与D 组比较，*P＜0.05。

3 讨 论

近年来，IVF 技术将造成孕妇妊娠风险的增高，并影响围生期胎儿的出生体质量及健康状况。在IVF 技术的COH 过程中，因药物干预可能出现多卵泡发育及高于自然周期的性激素水平[7]。COH 造成的机体高雌激素水平不仅对新鲜周期的OHSS 发生风险带来影响，更对新鲜周期的临床结局带来了不良后果。

本研究是一项基于大样本量的回顾性队列研究，共纳入了11 823 个周期，8 000 余例患者。结果显示，COH 周期hCG 日的E2 水平与患者年龄及BMI 相关。在COH 周期中促排卵药物应用方面，发现Gn 总量使用和E2 水平呈负相关。提示应用多少促性腺激素可能不是hCG 日E2 水平的决定性因素，更可能与患者自身条件相关，提示对预期卵巢反应较好、较年轻的患者，Gn 启动及维持剂量无需过高，更要预防OHSS 的发生。

本研究提示COH 高雌状态并不对胚胎早期的质量及发育(受精率、卵裂率、有效胚胎率)造成明显影响。在离开COH 导致的高雌环境后的FET 周期中，患者妊娠率及活产率随着E2 水平的升高均呈上升后少许下降的趋势，故一定范围内的高雌激素可能会有更好的临床结局，有待于扩大样本进一步的对照性前瞻研究验证。

本研究发现hCG 日E2 水平不对移植周期的双胎率、宫外孕、流产率产生影响；亦不影响单胎妊娠患者早产率、剖宫产率、分娩孕周及妊娠期高血压、妊娠期糖尿病的发病率。因此，在FET 周期正常E2水平中行胚胎移植，可能可以避免一部分新鲜移植周期中COH 高雌状态对子宫内膜容受性或其他方面的影响，一定雌激素水平反而有利于提高临床妊娠率及活产率。

LBW 的出生将为孕产妇及社会带来巨大影响，不仅提高了近期住院率及新生儿死亡率[8]，更会带来远期的健康风险，包括一系列生理及行为发育问题，如肥胖、糖尿病、消化系统疾病、自闭症、抑郁症、焦虑症等[9]。随着COH 周期E2 水平的升高，当E2 水平＞5 903 pg/mL 时，FET 周期中低体质量儿出生率明显上升，几乎是E2 水平＜5 903 pg/mL 时的两倍。提示尽管通过FET，已经避免了高雌状态对子宫内膜容受性等一些因素的影响，但高雌状态似乎仍通过某种方式，影响了胚胎质量或其他方面，最终导致了低体质量儿出生率的升高。高雌状态对FET 周期造成影响的具体机制还有待进一步探索。

目前有基础研究提示过高的雌激素将对卵子质量及发育造成影响。对ART 技术孕妇胎盘DNA 甲基化影响的研究[10]发现ART 技术将导致胎盘中CDKNIC(KvDMR1)基因中差异性甲基化区域(differentially methylated region,DMR)甲基化下调及胰岛素样生长因子2(H19 DMR)的上调。更多研究[11]提示，父源性表达基因包括PLAGL1、PEG1/MEST、PEG3 及母源性表达基因如GRAB10、H19、TSSC3、MASH2 和MEG3 等均受到COH 中雌激素水平的影响，过高或过低的雌激素水平将下调或上调基因的表达，并影响胎盘发育、胎儿宫内生长及胎儿出生体质量。由此可见，尽管在FET 周期中，患者已经离开COH 周期的高雌状态，避免了过高雌激素水平对子宫内膜容受性及胎盘植入的不良影响，减少对妊娠率、活产率、妊娠期并发症发生率等的不良影响，但高雌状态对卵子及胚胎造成的影响无法避免。

综上所述，FET 周期的临床结局已较大程度地摆脱了COH 周期高雌状态的影响，但FET 周期单胎妊娠中，胎儿的出生体质量及LBW 发生率受到COH 高雌状态的不良影响。因此在COH 过程中，为了获得FET 周期更高的妊娠率及活产率，且不对妊娠及围生期临床结局造成不良后果，应将hCG 日雌激素水平控制在一定范围内。