咳嗽变异性哮喘病理机制及造模方法的研究进展*

陈婷婷 易桂生

(桂林医学院附属医院呼吸科，桂林 541000)

咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma，CVA)是一种类型比较特殊的哮喘，它主要以咳嗽为临床表现[1]。CVA 是慢性咳嗽的主要病因之一[2]。CVA的基本特征是对支气管扩张药治疗延长了非生产性咳嗽，无喘息或呼吸困难史，听诊无喘息音，正常咳嗽反射敏感性和支气管反应性略有增加[3]。目前，很多学者认为CVA是典型哮喘的前体疾病或是典型哮喘在气道炎症比较轻微状态下的一种过渡性表现，30%的CVA可能会演变成为典型哮喘[4-5]。因此，CVA的早期发现、早期治疗就显得尤为重要。本文将现有CVA模型加以综述，比较其优缺点，以期未来能复制出理想的CVA动物模型，为CVA的防治和研究提供有效的途径。

1 咳嗽变异性哮喘病理生理改变

1.1 CVA的病理生理机制

气道慢性炎症反应是一种多因子共同参与和相互作用的特殊反应，它涉及多种炎症细胞、炎症介质以及细胞因子[6]。众多研究表明，辅助性T淋巴细胞亚群功能紊乱是CVA发病中的一个重要环节，其发展主要与T辅助2(Th2)淋巴细胞过度激活有关[7]。有人提出过敏性哮喘最初是由过敏原暴露引起的2型免疫机制激活不当引起的。这随后导致气道局部改变，包括气道上皮细胞的改变，如杯状细胞增生、屏障完整性改变和上皮下细胞外基质(ECM)等重塑过程[8]。CD4 T 淋巴细胞主要分为 Th1和 Th2 两个亚群，分别具有免疫调节、抗感染和抗变态反应的作用，二者在正常人体内呈平衡状态；Th2细胞通过释放2型细胞因子(如促进B细胞合成免疫球蛋白的IL-4)来启动过敏性哮喘的免疫反应[9]。其中，IL-4 是 Th2 细胞的自分泌生长因子，能促进 B 淋巴细胞合成免疫球蛋白(IgE)和使Th0 细胞分化为 Th2 细胞，IL-4也具有炎症趋化因子的作用可导致炎症细胞浸润[7]。

1.2 气道高反应性与CVA

气道高反应性(AHR)是指气道对一系列刺激因素(如食物、药物、空气中各种致敏原等)刺激时所呈现的高度敏感状态，目前更多认识是持续性的慢性气道炎症反应是导致AHR最重要的发病机制。当气道受到过敏原或其他刺激后， 在多种炎症细胞(如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞)、炎症介质和细胞因子共同反应下，气道上皮和上皮内神经会受到损害而导致AHR[10]。研究表明，CVA与典型哮喘患者具有相似的气道高反应性和小气道功能障碍[11]。 陈树煜等[11]发现典型哮喘激发实验阳性组[TA BPT(+)]和典型哮喘舒张实验阳性组[TA BDT(+)]激发实验前后IOS指标变化量较CVA大，提示患有典型哮喘者对不同剂量下乙酰甲胆碱刺激所产生的反应明显高于CVA患者，同时气道高反应性也较CVA更加敏感。从而证明了CVA是CV的早期阶段，推测CVA、TA BPT(+)、TA BDT(+)是CV的不同阶段。当CVA未控制可发展为TA BPT(+)；继续进展可出现气道功能改变(气道高反应性增加，气道重塑加重)及肺功能进一步损害，慢慢发展为TA BDT(+)，再进展为典型哮喘。

1.3 气道重塑与CVA

气道重塑的病理改变有：气道上皮结构受损、上皮细胞、纤维母细胞肥大增生、上皮下网状基底膜增厚、细胞外基质增加、新生血管形成等改变[12]。还有研究表明[13]缺乏维生素D可激活Wnt5a/β-catenin 通路活性，增加CVA大鼠气道炎症反应和气道重塑的构建。Niimi等[14]通过对哮喘患者行支气管黏膜活检测量基底膜厚度，证实了典型哮喘患者气道重塑较CVA患者更严重。Matsumoto等[15]发现 CVA 患者的中央性气道壁厚度增加，而NAC(非哮喘性慢性咳嗽)患者的中央气道壁增厚较小，而CVA患者程度与NAC相比较则增厚较大，但两组之间的气道管腔面积却无差异。这表明CVA 患者具有气道基底膜增厚的特点，且CVA患者与健康对照组相比较，CVA患者的小气道炎症细胞、气道管径和杯状细胞面积均有所增加，推断出这些结构的改变可能使CVA患者气道壁增厚。气道黏膜在暴露于各种机械力作用下会刺激细胞生长并调节细胞外基质的沉积，这为以后进一步研究气道基底膜改变提供了一个新的研究方向[16]。

2 CVA的造模

2.1 大鼠CVA模型

目前，我国最常使用的大鼠CVA造模品种，都以SD大鼠、Wister大鼠为主。现在很多研究团队也在尝试使用Brown-Norway(BN)大鼠来复制CVA模型。现在关于大鼠CVA模型的构建，常用的试剂及仪器大同小异，我们通过查阅文献，列举以下几种方法。

2.1.1实验方法Ⅰ[18-19]：第1天造模组腹腔注射1 mL混合液，包括 2 mg 卵蛋白(OVA)和 100 mg 氢氧化铝凝胶。3周后，再次腹腔注射1 mL混合液，包括0.01 mg OVA 及100 mg氢氧化铝凝胶。正常组注射等量的生理盐水。3周后，模型组和给药组开始用 1% OVA 对大鼠进行玻璃罩内雾化，正常对照组用生理盐水，雾化，时间为隔日一次，共7次，最后一次雾化结束后用1×10-4mol/L辣椒素雾化2 min诱咳，用测肺功能(激发实验)的方法判断效果，比较模型组与正常对照组咳嗽次数的变化，采用有创肺功能检测方法，观察不同剂量下乙酰甲胆碱激发实验中大鼠吸气总气道阻力(RL)和动态顺应性(Cdyn)趋势的变化情况。

2.1.2实验方法Ⅱ[19-21]：每只大鼠以配制好的1 mg/mL OVA与氢氧化铝凝胶混合液，进行皮下注射，注射部位分别为两后足跖、腹股沟区、腰、背、颈部等10个部位，每个部位皮下注射 0.05 mL溶液，同时腹腔再次注射0.5 mL溶液，在1周后用相同的方法重复注射1次，以致加强致敏。第15天，用1%OVA溶液进行雾化吸入20 min以激发哮喘，或是以OVA和氢氧化铝凝胶佐剂直接腹腔注射后，第15天进行用OVA雾化进行激发，加强致敏效果，若观察到大鼠腹肌明显收缩则为阳性，直到出现呼吸快、深、急促等气道痉挛表现则提示造模成功。再用1×10-4mol/L辣椒素激发实验考察各组大鼠的咳嗽时气道敏感性。

2.1.3实验方法Ⅲ[22]：通过腹膜内注射1 mg OVA+10 mg氢氧化铝凝胶混合液进行1次OVA致敏，并在21 d后，在大鼠鼻内滴注含有75 μg OVA的生理盐水，所有组均接受OVA攻击。此方法通过测定AHR来评估。文献中未对测定结果是否是CVA模型成功的评估做出具体说明。

通过比较以上三种常用方法可以得出实验方法Ⅰ更倾向于用实验方法评估大鼠的气道高反应性以及大鼠对咳嗽敏感性的变化来证实造模的成功与否。实验方法Ⅱ针对大鼠的多部位注射，实施起来比较困难，评估办法仅对咳嗽次数进行了客观评价，在气道高反应性上却未进行研究和提供相应的实验数据，来比较两组模型变化。实验方法Ⅲ只在测定气道高反应性是否增加，未说明是否是CVA模型成功的判断。

2.2 豚鼠CVA模型

豚鼠CVA造模方法基本都是参照以下方法进行的。

Nishitsuji等[3]参照Muraki等[23]方法进行了造模，方法如下：第1天，在豚鼠腹腔内注射30 mg/kg环磷酰胺溶液，用来增加气道高反应性，2 d后腹腔注射OVA 2 mg与氢氧化铝凝胶100 mg，3周后再次腹腔注射OVA 0.01 mg与氢氧化铝凝胶100 mg。再隔3周以后，在豚鼠腹腔内注射20 mg/kg苯海拉明溶液抗过敏反应，30 min后雾化吸入1%OVA溶液90 s。评判标准为测量模型组和正常组之间咳嗽次数和不同剂量乙酰胆碱下气道特异阻力(sRaw)的变化情况。咳嗽是一种短暂的压力变化(一种快速的灵感，然后是快速的过期)，无视鼻腔运动和打喷嚏等相关性的压力变化，动物的运动被视觉监测。咳嗽次数由经过训练的观察者统计，并通过特征姿势和压力传感器来识别。目前，此方法应用较为广泛[24-25]。

蔡黎等[26]根据经典哮喘模型的造模方式衍生出针对豚鼠CVA模型的制作，方法如下：第1天，肌肉注射4%OVA溶液0.5 mL，同时腹腔注射2%氢氧化铝凝胶0.2 mL；14 d后，CVA模型组用10 mg/mL的OVA溶液雾化吸入，15 s/次，隔天雾化1次，共7次；第29天，用1×10-4mol/L辣椒素溶液引咳建立CVA豚鼠模型。雾化吸入1×10-4mol/L 辣椒素溶液, 用特征姿势和压力传感器记录2 min内各豚鼠的咳嗽次数。评判标准:①造模后总体外观；②肺病理切片观察、炎症细胞浸润情况，以嗜酸性粒细胞(EOS)为主；③肺泡灌洗液(BALF)中的细胞计数及分类，重点是以EOS是否升高为判断；④生理功能指标，如气道阻力、气道压力、顺应性等。到28 d成模时，豚鼠死亡率为13%，总结为该模型制造方法死亡率较高，稳定性较差。

高明等[27]在参考经典哮喘模型构建方法的基础上，结合熏烟的方式，增加豚鼠气道的高反应性，诱使咳嗽反应。通过比较两组模型，探讨建立与临床表现及特征相似度更高的CVA模型。方法如下：模型1组(CVA组)：1～29 d，熏烟 30 min/d；第15天，每只豚鼠注射 2% OVA 1 mL 和 200 mg氢氧化铝凝胶；第22天，每只豚鼠注射 2% OVA 1 mL和200 mg氢氧化铝凝胶加强致敏1次，第29～35天，用 1% OVA雾化吸入，1次/d，连续7 d。模型2组(CV组)不用烟雾攻击，在第15天，每只豚鼠注射同样注射2% OVA 1 mL和200 mg氢氧化铝凝胶；第22天，每只豚鼠注射 2% OVA 1 mL和200 mg氢氧化铝凝胶加强致敏1次，第 29～35 天用 1% OVA 雾化攻击，1次/d。连续7 d，最后观察两组豚鼠之间的咳嗽次数及不同浓度乙酰胆碱激发实验下气道阻力(RI)的统计学差异。结果表明：咳嗽反应结果表明，熏烟使模型1组豚鼠的咳嗽次数比模型2组增加，但两组之间的咳嗽次数比较显示差异无统计学意义。气道阻力结果显示：模型2组的RI随着乙酰甲胆碱的浓度升高而逐渐升高，模型1组的RI 在低浓度激发时反应高于模型2组，但在高浓度下与模型2组比较差异无统计学意义。总结为模型1组的豚鼠表现与临床CVA患者的基本症状和特征是相似的。但该模型依然存在豚鼠死亡率较高的问题，模型是否稳定需进一步探索与完善。

2.3 小鼠CVA模型

小鼠CVA模型制造，方法如下[28-30]：在第1天和第14天分别通过腹膜内注射80 μg OVA 0.1 mL和等体积的氢氧化铝凝胶溶液致敏。自第2次致敏后的第10天开始，用1.5%OVA溶液雾化攻击小鼠持续20 d。麻醉后将小鼠暴露于浓度不断增加的乙酰甲胆碱(0～50 mg/mL)中，使用Buxco Pulmonary机械系统来评估这些小鼠插管中的肺气道阻力。由于小鼠体积小，活动更加灵活，注射、灌胃等操作实施较困难，且自主呼吸时咳嗽及肺功能测定存在技术难度，因此，应用小鼠制作CVA模型在一定程度上受到限制，因此并未成为常规造模动物。

3 总结

CVA和CV具有相似的嗜酸性粒细胞浸润和相关的Th1/Th2细胞失衡等发病机制，CVA是慢性咳嗽最常见的原因之一[9]。CVA患者发生气道上皮下层增厚，但程度低于CA患者。针对CVA的病理生理研究，成熟、完善的模型制作方式就显得格外重要。目前，CVA动物模型中采用的实验试剂基本相似，只是在实验方法上不尽相同。不同的造模方法使得CVA模型的建立也不相同，这种差异对实验结果及临床意义也有一定影响，研究人员需要在造模方式下更加研究推敲，试剂用量也需反复进行研究和探索，分析并比较造模后动物各项指标的差异，以建立和临床更加相似的相对成熟稳定的CVA动物模型[27]。根据上述不同动物CVA模型的建立方法，总结以下几点评估CVA模型是否成功的条件：①观察动物的体征变化，如毛发改变、咳嗽情况、腹肌抽搐等气道痉挛。②气道高反应性变化否满足，无论是无创或是有创操作，通过观察气道阻力的变化。③肺病理切片中炎症浸润，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞计数。

4 展望

CVA被认为是支气管哮喘(CA)的前期表现形式。然而，这些类似疾病对支气管收缩的咳嗽反应不同。反复支气管狭窄内源性脂质介质的失衡可能影响咳嗽反应。Yamamura等[31]研究表明反复支气管收缩可减轻支气管收缩的咳嗽反应。支气管收缩产生的内源性脂质介质也影响咳嗽反应。反复支气管扩张收缩和由此产生的内源性脂质介质失衡可能是导致CVA和BA之间支气管收缩的不同咳嗽反应的因素。此外，它可能是CVA进展到典型的CA的一种机制。FeNO主要由于气道上皮细胞所产生，当气道发生炎症反应时，气道上皮细胞内的一氧化氮合酶(iNOS)表达增加，使FeNO水平升高，因此 FeNO可作为反应和监测气道炎症的标记物，这一系列反应主要与气道嗜酸性炎症有密切关[32]。Zhang等[33]通过mate分析表明在CVA患者持续存在慢性气道炎症的情况下，上皮细胞中的可诱导型 iNOS活性增加，从而导致呼出气中检测到的NO水平明显升高。FeNO测试用于CVA的诊断具有很高的价值。但是，需要进一步的研究以更大的样本量和亚组分析来确认当前的结论。因此，我们提出该假设：能否在动物模型制备后进行小气道炎症反应的检测(包括无创或有创的FeNO检测)，来进一步佐证模型和临床CVA病理机制更加相近，从而证实模型的成功？这可能对推进CVA发病机制研究及挖掘诊治新靶点更加有益处，还更有助于CVA患者未来诊断的明确化和治疗中的个体化。