液相色谱串联质谱法测定食品中淫羊藿苷等20种功能成分

范小龙 陈 冉 吴婉琴 刘国姣 黄 坤 江 丰

(1.湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北 武汉 430000；2.湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心，湖北 武汉 430000)

淫羊藿苷、金丝桃苷、刺五加苷B、仙茅苷、补骨脂苷、党参炔苷、β-蜕皮甾酮、刺五加苷E、黄芪甲苷、补骨脂素、水晶兰苷、丹参酮IIA、大黄素、欧当归内酯A、红景天苷、特女贞苷、黄芪皂苷I、蟛蜞菊内酯、莫诺苷为糖苷类化合物，这些化合物是20种不同的中药材功能成分，具有补肾壮阳、抗疲劳、增强免疫力等作用。由于这些化合物功效比较明确，因此不法商家往往以“食疗”为噱头，向普通食品中添加这些中药材。例如：含有“生地”的炖鸭煲调料包；含有“党参”“木香”“白术”的茶叶；含有“女贞子”和“淫羊藿”的椰园海宝(干制水产品)；含有“红豆杉”和“金樱子”的配制酒；含有“杜仲”和“淫羊藿”的饮料等。在食品中违法添加中药材对人体健康具有潜在或显性的危害，就中药材的性质而言，中药材都有明确功能主治、适用人群、用法用量，具有与食品完全不同的功效和服用禁忌[1]。目前已报道补骨脂及其制剂会造成肝损伤[2-3]，金丝桃苷具有胚胎毒性[4]，淫羊藿具有心脏毒性、神经毒性[5]。

中国《食品安全法》第三十八条明确规定“生产经营的食品中不得添加药品，但是可以添加按照传统既是食品又是中药材的物质。”为打击向普通食品和保健食品中违法添加中药材的行为，2017年5月，湖北省食品药品安全办、省食药监管局联合省工商局也开展专项行动工作，明确重点打击非法添加，其中就重点查处普通食品和保健食品中违法添加药材的行为。2017年10月，贵州也开展严厉打击使用非食品原料生产食品违法行为整治，其中就重点查处了在配制酒、饮料、茶叶及相关制品、蔬菜制品等普通食品生产加工中使用人参、三七、天麻、当归、红景天、杜仲等可用于保健食品的药材或八角莲、马钱子、生半夏、红豆杉、洋地黄、雷公藤等保健食品禁用药材。但是在执法过程中，监管部门执法人员只能通过查看产品配料表和到企业现场巡查等最传统的方式来判断食品中是否违法添加中药材，但往往会因生产企业不如实标注配料表或生产现场对非法添加的中药材原料进行隐藏等情况，形成监管盲区。现有食品中中药材化合物的测定方法主要集中在保健食品中[6-9]，普通食品中无相关参考方法，且普通食品基质相比保健食品复杂，因此选择合适的仪器及相关的前处理方法极为重要。超高效液相色谱—串联质谱具有灵敏度高，分析时间短，定量准确的特点，非常适用于食品中非法添加物的鉴别和定量[10-12]，极大限度地缩短鉴别时间，降低鉴别的复杂性。试验拟针对配制酒、饮料、代用茶等普通食品中非法添加淫羊藿、菟丝子、补骨脂等可用于保健食品的中药材，建立中药材中功效成分的超高效液相色谱串联质谱的方法，以期为打击此类违法行为提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

淫羊藿苷、金丝桃苷、刺五加苷B、仙茅苷、补骨脂苷、党参炔苷、β-蜕皮甾酮、刺五加苷E、黄芪甲苷、补骨脂素、水晶兰苷、丹参酮IIA、大黄素、欧当归内酯A、红景天苷、特女贞苷、蟛蜞菊内酯、莫诺苷、异补骨脂素、类叶升麻苷标准品(见表1)：纯度均≥98%，上海源叶生物科技有限公司；

乙腈、甲醇：色谱级，美国Fisher公司；

甲酸铵：色谱级，麦克林公司；

表1 20种化合物的CAS登录号及分子式Table 1 Chinese names,CAS accession numbers and molecular formulas of 20 compounds

微孔滤膜：0.22 μm，有机系，天津市津腾实验设备有限公司；

试验用水：超纯水，电阻率≥18.2 MΩ·cm(25 ℃)，美国Millipore公司。

1.2 仪器与设备

三重四极杆串联质谱仪：Triple Quad 4500型，美国AB SCIEX公司；

超高液相色谱仪：Ultimate 3000型，美国Thermo公司；

电子分析天平：XS204型，梅特勒—托利多国际贸易(上海)有限公司；

电子分析天平：ME2002E型，梅特勒—托利多国际贸易(上海)有限公司；

高速离心机：Allegra X-15R型，美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

(1) 标准储备液：准确称取各标准品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1.0 mg/mL标准储备液，4 ℃保存。

(2) 混合标准中间液A：准确移取刺五加苷B、黄芪皂苷I、黄芪甲苷、刺五加苷E、欧当归内酯A、莫诺苷、丹参酮IIA标准储备液各100 μL；补骨脂素10 μL至100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，则刺五加苷B、黄芪皂苷I、黄芪甲苷、刺五加苷E、欧当归内酯A、莫诺苷、丹参酮IIA浓度为1.0 μg/mL；补骨脂素浓度为0.1 μg/mL，4 ℃保存。

(3) 混合标准中间液B：准确移取淫羊藿苷、金丝桃苷、仙茅苷、党参炔苷、特女贞苷标准储备液50 μL；补骨脂苷、β-蜕皮甾酮、水晶兰苷、红景天苷、类叶升麻苷标准储备液100 μL；大黄素、蟛蜞菊内酯标准储备液10 μL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，则淫羊藿苷、金丝桃苷、仙茅苷、党参炔苷、特女贞苷浓度为0.5 μg/mL；补骨脂苷、β-蜕皮甾酮、水晶兰苷、红景天苷、类叶升麻苷浓度为1.0 μg/mL；大黄素、蟛蜞菊内酯浓度为0.1 μg/mL，4 ℃保存。

1.3.2 样品前处理

(1) 配制酒：准确称取1.00 g试样置于50 mL蒸发皿中，80 ℃水浴蒸15 min，残渣加入10 mL甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=1∶1)洗涤，洗涤液转移至25 mL容量瓶中，洗涤两次，合并洗涤液，摇匀，超声30 min，冷却至室温后，用甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=1∶1)定容至刻度，混匀静置10 min，准确吸取2.5 mL上清液至10 mL容量瓶中，用甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=1∶1)定容至刻度，混匀，经0.22 μm滤膜过滤，取滤液，根据实际浓度适当的稀释至工作曲线线性范围内，供高效液相色谱—串联质谱测定。

(2) 饮料：准确称取1.00 g试样置于100 mL容量瓶中，加入适量甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=1∶1)，超声30 min，冷却至室温后，用甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=1∶1)定容至刻度，混匀，经0.22 μm滤膜过滤，取滤液，根据实际浓度适当的稀释至工作曲线线性范围内，供高效液相色谱—串联质谱测定。

(3) 代用茶：准确称取1.00 g试样置于25 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=1∶1)，摇匀，超声30 min，冷却至室温后，用甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=1∶1)定容至刻度，混匀静置10 min，准确吸取2.5 mL 上清液至10 mL容量瓶中，用甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=1∶1)定容至刻度，混匀，经0.22 μm滤膜过滤，取滤液，根据实际浓度适当的稀释至工作曲线线性范围内，供高效液相色谱—串联质谱测定。

1.3.3 液相色谱参考条件的优化 对比选择不同的色谱柱和不同的有机相与水溶液比例及水溶液中添加不同的物质含量，通过比较色谱峰及分离度，选择合适的色谱柱和流动相；并对梯度进行调节优化，以达到分离度高、峰形好和响应最佳的色谱行为，从而确定液相色谱条件。正模式下的色谱条件见表2，负模式下的色谱条件见表3。

(1) 液相色谱条件A组：色谱柱为Thermo Acclain RSLC C18(2.6 μm，2.1 mm×100 mm)；流动相A为乙腈，B为超纯水，梯度洗脱程序见表2；柱温35 ℃；进样量3 μL。

(2) 液相色谱条件B组：流动相A为乙腈，B为超纯水，梯度洗脱程序表3；其余同液相色谱条件A组。

1.3.4 质谱参数条件的优化 在ESI+和ESI-模式下分别确定各目标化合物的母离子，对选定的母离子进行离子扫描，根据二级碎片离子扫描质谱图及可能的断裂规律，分别选取丰度相对较强的一对碎片离子作为定量离子，次强的一对或两对碎片离子作为定性离子，并分别对子离子的碰撞能量进行优化，最后在多反应监测模式(MRM)下分别对去簇电压(DP)、碰撞能(CE)进行优化。气帘气(CUR)、雾化气(GS1)、辅助气(GS2)、碰撞气(CAD)均为高纯氮气或其他合适气体，使用前应调节相应参数使质谱灵敏度达到检测要求，电喷雾电压(IS)、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)等参数使用前应优化至最佳灵敏度，监测离子对和定量离子对等信息详见表4。

1.3.5 前处理条件的优化 比较不同的提取溶剂、提取方式及净化方式对提取过程的影响，以目标化合物的回收率为指标，确定提取条件。

1.3.6 方法学验证

(1) 定量限：分别选择配制酒、液体植物饮料、代用茶为3种空白样品，采用逐步定量的方式添加标准溶液，按照1.3.2处理样品，正、负离子分开扫描进样，至定量离子、定性离子信噪比均大于10时添加浓度即为定量限。

(2) 回收率和精密度：不同的基质样品进行低、中、高3个水平添加，每个添加水品平行测定6次，分别测定回收率；同一个基质项下的相同添加水平下的化合物6次测定的回收率来计算平均回收率，并计算出精密度(相对偏差)。

表2 梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution conditions

表3 梯度洗脱程序Table 3 Gradient elution conditions

1.3.7 数据处理 相关质谱数据由Analyst分析软件采集，MultiQuant定量软件分析数据。数据汇总后，经过Microsoft Office Excel进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的确定

研究的化合物绝大多数极性较弱，因此主要考察常规反相色谱柱分离效果，分别选用ACE Excel 2 C18(2.1 mm×100 mm)、Waters ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)、Thermo Acclain RSLC C18(2.6 μm，2.1 mm×100 mm)3种实验室常用的色谱柱。结果表明，ACE Excel 2 C18色谱柱峰形拖尾，Waters ACQUITY UPLC BEH C1850 mm柱子由于出峰时间较快，杂质易与目标化合物产生干扰，而18种化合物在Thermo Acclain RSLC C18(2.6 μm，2.1 mm×100 mm)均具有较好的峰型和分离效果，因此，选择Thermo Acclain RSLC C18色谱柱开展后续试验，见图1。

2.2 流动相的确定

比较了0.1%甲酸水溶液、5 mmol/L甲酸铵溶液、纯水3种流动相对目标化合物分离效果的影响。通过对比在流动相中加酸对目标物分离的影响，发现在流动相中添加0.1%甲酸或者5 mmol/L甲酸铵，正模式扫描情况下，并没有对化合物的峰形及保留时间有很大的改善，均有化合物的峰出现分叉，可能是由于中药材化学成分均属于糖苷或者黄酮类，化合物性质较特殊，化学性质差别较大。反而，流动相为纯水时，化合物的分离峰形均有改善(见图2)，可能是由于在流动相中加入酸或者盐对目标化合物有抑制作用。另外，结合单独进行负离子模式扫描时，采用不加甲酸的流动相会提高负离子模式下的灵敏度，考虑到有的实验室有性能较好液相色谱—质谱联用仪，将采用正负同时扫描模式一次检测20种中药材物质，所以方法最终选择了可以正、负离子模式兼容的流动相——纯水。

2.3 质谱条件的确定

试验比较了20种中药材物质在正、负离子两种检测模式下的灵敏度，发现刺五加苷B、黄芪皂苷I、刺五加苷E、黄芪甲苷、补骨脂素、丹参酮IIA、欧当归内酯A、莫诺苷8种物质在正离子下响应较好，因此，这8种物质采用正离子模式，见表4。还在同一方法下采用正、负离子模式同时扫描和分正、负离子模式两次分别检测，发现在AB Sciex 4500液相色谱—质谱联用仪上正、负离子模式同时扫描采集能够达到试验方法的检出限要求，但在waters TQD液相色谱—质谱联用仪上正离子可以达到方法的检出限，负离子中有几种在定量限浓度相应值较低，而分正模式、负模式二次单独采集后，不同质谱的正、负离子模式均能达到方法的定量限。因此，为了使方法具有普遍适用性和易于推广使用，最终选择采用分正、负离子模式二次单独检测。但如果实验室具有性能较好的液相色谱—质谱联用仪时，也可以同时采用正、负离子模式同时扫描一次检测。

图1 标准物质正模式(刺五加苷B等8种)及负模式(淫羊藿苷等12种)下总离子流色谱图Figure 1 Chromatogram of total ion of 8 constituents in positive mode and 12 constituents in negative mode

图2 不同流动相下补骨脂素、黄芪甲苷及莫诺苷的正模式下总离子流图Figure 2 Chromatogram of total ion of psoralen、astragaloside IV and morroniside in positive mode of different mobile phases

2.4 基质确定

试验方法适用于配制酒、饮料、代用茶添加中药材物质的测定，通过市场调研和网上购物平台调查，对宣称或暗示补肾壮阳及抗疲劳、抗氧化的食品进行数据统计，发现最有可能非法添加的食品基质是配制酒、液态植物饮料(酵素饮料)及代用茶。并且这3种基质涵盖了检测方法涉及的主要几种产品类型，以及产品类型所涉及的物理形态，同时对配制酒、饮料及代用茶中可能含有的挥发性酯类、亲水性多糖、鞣质、蛋白质以及叶绿素等复杂成分均予以考虑。因此，选用的3种样品基质可以代表方法适用的产品范围。在进行方法开发和验证实验时，选择不含20种中药材物质的配制酒、饮料及代用茶作为基质。

2.5 前处理方法的确定

2.5.1 提取溶剂优化 由于试验方法涉及20种目标化合物，而且不是一类结构相近的化合物，为了使所有的化合物都能有较高的提取率，在提取溶剂上分别考察了不同比例的甲醇—水作为提取溶剂。

固体类样品(代用茶)，由于粉碎后茶叶基质微孔结构对目标化合物具有一定吸附性，因此提取溶剂中需要加入一定比例的水，使其组织溶胀，提取液渗透至微孔内部，进而提高回收率。方案为：称取粉碎后的阴性茶叶基质1 g于50 mL的容量瓶中，添加混标静置1 h后，采用不同比例甲醇—水提取，当提取溶剂水相比例增大时，茶叶中的水溶性色素、亲水性多糖、鞣质等杂质更容易提取出来，产生基质效应造成回收率显著降低，因此采用V甲醇∶V水分别为1∶9，3∶7，5∶5，8∶2，10∶0的甲醇—水提取，测得20种化合物平均回收率见图3。结果表明，选择甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=5∶5)作为提取溶液时，20种化合物回收率相比其他比例提取条件，具有更好的提取效果，因此选择甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=5∶5)作为固体类样品(代用茶)提取溶液；配制酒因为含有乙醇及挥发性酯类，通过蒸发皿蒸发挥发掉一部分杂质再进行溶解稀释提取；饮料样品也只需要溶解稀释来提取。

2.5.2 提取方式优化 采用阴性基质加标方法考察30 min 振荡提取、均质提取、超声提取3种提取方式的影响，通过回收率进行评价比较，对于固体基质，超声提取方式的回收率与均质提取相当，但明显高于振荡提取方式。超声提取简单易行，因此3种基质均选择超声提取30 min。

2.5.3 净化方式选择 由于配制酒、饮料及茶叶中可能存在亲水性多糖、鞣质、蛋白质或叶绿素等复杂成分，为保证提取效率的同时排除基质干扰，则需要选择合适的净化方式，分别考察了固相萃取柱法、直接稀释法，通过阴性样品基质加标，以回收率考察净化效果。

(1) 固相萃取柱选择：HLB为通用型的反相保留固相萃取柱，PRime HLB为通过式净化除杂，HLB、PRime HLB固相萃取柱进行前处理净化，通过对上样、淋洗、洗脱各种组合条件进行优化，回收率结果表明对水晶兰苷、黄芪甲苷、特女贞苷等经HLB柱净化后回收率为10%～40%，采用Prime HLB净化，净化效果有限，水晶兰苷、黄芪甲苷、特女贞苷等回收率仍小于50%，因此HLB、PRime HLB固相萃取柱对20种化合物净化方案不可行。

图3 代用茶中20种化合物平均回收率Figure 3 Average recovery of 20 compounds in substitute tea (n=3)

(2) 直接稀释法：配制酒及饮料样品采用甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=1∶1)进行溶解稀释，稀释倍数为50时，回收率在70%～120%，均可满足要求。代用茶基质比较复杂，在进行选择不同溶剂提取比例试验，稀释50倍时发现金丝桃苷、特女贞苷、类叶升麻苷、刺五加苷B回收率大于120%，为了降低基质干扰，需要进行稀释。方案为：称取1 g粉碎后的阴性茶叶基质于25 mL容量瓶中，添加混标，静置1 h，加入20 mL甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=1∶1)超声提取30 min，冷却至室温，定容至刻度线，再采用甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=1∶1)分别稀释2，4，10倍。结果表明，当稀释4倍时，金丝桃苷、特女贞苷、类叶升麻苷、刺五加苷B等基质效应显著降低，满足70%～120%方法要求。因此考虑到方法检出限、回收率及仪器的响应值将稀释倍数定为4倍。

2.6 方法学的考察

2.6.1 定量限及线性范围 分别选择配制酒、液体植物饮料、代用茶3种空白样品，采用逐步定量的添加标准溶液方式，按照前处理方法步骤，正负离子分开扫描进样，至定量离子、定性离子信噪比均大于10时添加浓度即为定量限，测定的定量限：称样量为1 g，最后稀释倍数为100时，3种基质中各化合物的定量限为：刺五加苷B、黄芪皂苷、黄芪甲苷、刺五加苷E、欧当归内酯A、莫诺苷、补骨脂苷、β-蜕皮甾酮、水晶兰苷、红景天苷、类叶升麻苷、丹参酮IIA定量限为5 mg/kg；补骨脂素、大黄素、蟛蜞菊类酯为0.5 mg/kg；淫羊藿苷、金丝桃苷、仙茅苷、党参炔苷、特女贞苷为2.5 mg/kg。采用溶剂标曲进行化合物的定量，20种化合物线性最高浓度为500 ng/mL，最低点为定量限。

2.6.2 回收率及精密度 由于试验方法测定的物质在普通食品中均为禁用物质，因此化合物添加量为方法定量限、2倍方法定量限和10倍方法定量限进行3水平回收率试验，各化合物添加水平、回收率、相对标准偏差见表5。20种化合物添加水平在0.5～50.0 mg/kg，回收率范围为70.8%～113.4%，相对标准偏差范围为0.8%～8.5%，3种基质的重复性试验的回收率范围和相对标准偏差满足分析要求。

3 结论

试验建立了配制酒、饮料及代用茶等普通食品中非法添加淫羊藿苷、金丝桃苷、补骨脂素等20种功能成分定量的检测方法。该方法操作方便、简单、快捷、重复性好并且覆盖了大部分基质，可在大多数分析实验室推广应用。但是，由于该方法研究的化合物较多，不同的化合物灵敏度也不一致，因此前处理方法无法保证每一个化合物的回收率都能达到100%满意的结果，但均在70%～120%，满足日常检测的定量要求。今后可扩大检测基质体量、研究不同基质的前处理方式的优化以及如何更加有效去除基质的干扰，以期达到更全面、严格管理监测这类中药材或药物的使用。

表5 20种物质在配制酒、液体饮料及代用茶基质中的回收率Table 5 Recovery of 20 substances in mixed liquor,liquid beverage and substitute tea (n=6)

续表5