血清MK 和Gal-3 水平在甲状腺结节及DTC 术后转移灶中的诊断价值

武晨 杜芬 刘师伟 马浩华 张海涛 刘静 张迎伟 罗丽萍 程艳,7

1 山西医科大学第一医院核医学科，太原 030001；2 中国医学科学院肿瘤医院深圳医院核医学科 518116；3 山西白求恩医院（山西医学科学院）内分泌科，太原 030001；4 太原市中心医院中心实验室 030001；5 山西医科大学第一医院普外科，太原 030001；6 山西医科大学第一医院检验科，太原 030001；7 山西省分子影像精准诊疗协同创新中心，太原 030001

随着医学科技水平的发展，医学检查方法愈趋多样化、医学仪器设备愈趋高端化，甲状腺结节在健康人群中的检出率也随之升高，达50%～60%[1]。目前细针穿刺活检被认为是术前诊断甲状腺结节良恶性的“金标准”，其诊断灵敏度达83%（65%～98%）、特异度达92%（72%～100%），但仍有15%～20%的患者不能被确诊，在这部分患者中，仅有20%～25%的患者经术后病理结果被诊断为恶性结节，75%～80%的患者接受了不必要的甲状腺手术[2]。另外，目前常用甲状腺球蛋白（thyroglobulin，Tg）水平预测转移情况，但其易受到抗甲状腺球蛋白抗体（thyroglobulin antibody，TgAb）的干扰，且部分术后行131I 治疗的DTC 患者在治疗中会出现Tg 水平较高而全身碘扫描结果显示阴性的情况，这会对临床诊断造成一定的困扰[3-4]。针对这些临床困惑，本研究通过检测血清midkine（MK）和galectine-3（Gal-3）水平来进行补充，以便临床医师更好地制定治疗方案和评估患者的预后。

1 资料与方法

1.1 甲状腺结节患者的一般资料

回顾性分析2016 年11 月至2017 年11 月于山西医科大学第一医院普外科拟行甲状腺切除术的甲状腺结节患者41 例，其中男性11 例、女性30 例，年龄29～73（48.61±11.59）岁，根据手术病理结果分为恶性组和良性组。同时收集体检中心体检的32 名健康者为健康对照组，其中男性15 名、女性17 名，年龄24～58（46.00±11.18）岁。

41 例甲状腺结节患者中，恶性组有23 例，男性6 例、女性17 例，年龄30～73（47.39±11.52）岁，其中甲状腺乳头状癌19 例、甲状腺微小乳头状癌4 例；良性组有18 例，男性5 例、女性13 例，年龄29～65（46.00±11.18）岁，其中结节性甲状腺肿17 例、甲状腺嗜酸性细胞腺瘤1 例。纳入标准：甲状腺结节拟行手术切除者。排除标准：良恶性结节并存；合并有桥本甲状腺炎等其他甲状腺疾病；合并有其他部位肿瘤、冠心病、糖尿病、肝肾疾病、感染性疾病。

1.2 DTC 术后患者的一般资料

回顾性分析2016 年11 月至2017 年11 月于山西医科大学第一医院核医学科行2 次131I 治疗并于每次治疗5～7 d 后行全身碘扫描显像的DTC 术后患者51 例，其中男性12 例、女性39 例，年龄25～72（44.41±10.21）岁。纳入标准：首次行131I 治疗的甲状腺全切术后的DTC 患者，且术后进行了2 次131I 治疗。排除标准：甲状腺全切术后未行2 次131I 治疗的DTC 患者。

上述2 项回顾性研究均符合《赫尔辛基宣言》的原则。

1.3 131I 治疗和全身扫描

51 例DTC 术后患者行131I 治疗前停服左旋甲状腺素钠片（德国默克公司） 3～4 周，并低碘饮食2～4 周。清甲前告知患者治疗目的、可能的不良反应及注意事项，并签署131I 治疗同意书。第1 次放射性131I（原子高科股份有限公司，放射化学纯度＞95%）治疗时，空腹一次性口服3.7 GBq（对于存在摄取131I 转移病灶的患者给予 3.7～7.4 GBq）。治疗后第3 天开始口服左旋甲状腺素钠片替代治疗，5～7 d 后使用德国Siemens 公司的 Symbia SPECT/CT仪行131I 全身扫描，配高能通用型平行孔准直器，参数：能峰364 keV、窗宽20%、矩阵256×1024、放大倍速1.0。3～6 个月后行第2 次131I 治疗，治疗后5～7 d 行全身碘扫描。每次131I 治疗后对 DTC 患者的治疗后效果及转移情况进行评估。

1.4 图像分析及判断标准

由2 位副主任及以上职称的核医学医师对全身碘扫描图像进行判读，意见不统一时，经讨论及第3 位医师评定后达成一致意见。DTC 患者淋巴结及肺转移判断标准：在2 次131I 治疗期间，经超声、CT、PET/CT 等影像学检查结果明确提示有淋巴结、肺等部位转移，和（或）2 次131I 治疗后在全身碘扫描中有甲状腺外组织（淋巴结、肺等）的131I摄取。密切随访所有 DTC 患者，随访时间为3～6个月，具有患者两次131I 治疗期间所有的采集数据。

1.5 血清学指标测定

1.5.1 血样的采集

甲状腺结节患者和DTC 术后患者均于空腹时采集血样，甲状腺结节患者收集术前血样（采集前禁食8 h 以上），测定血清MK 和Gal-3 水平；DTC术后患者收集首次服131I 治疗前的血样，并测定血清MK 和Gal-3 水平。所有血样均以3000×g 离心10 min 后分离血清。

1.5.2 血清Tg 水平的测定

使用德国Siemens 公司生产的IMMULITE 2000型全自动化学发光免疫分析仪测定Tg 水平(参考范围 1.69～59.90 ng/mL，最高可测值 500.00 ng/mL)。

1.5.3 MK 和Gal-3 水平的测定

使用上海江莱生物科技有限公司生产的抗体及相关试剂进行检测，检测仪器为美国赛默飞世尔公司的 FC 型全自动酶标仪。检测流程：①将微孔酶标板及待测样品室内放置20 min；②先后往标准品孔、样品孔中加入50 μL 不同浓度的标准品和待测样品及100 μL 辣根过氧化物酶标记的检测抗体；③封住反应孔，在37℃恒温箱内放置60 min；④从恒温箱内取出后，倒掉液体，用吸水纸拍干，孔内加满350 μL 洗涤液，放置1 min 后倒掉拍干，重复上述步骤4～5 次；⑤每孔加入底物MK、Gal-3 各50 μL，37℃避光孵育15 min；⑥每孔加入50 μL 终止液，在450 nm 波长下测定光密度值；⑦绘制标准曲线，计算各样品的浓度值。每个样品血清或标准品均重复测定2 次。

1.6 统计学分析

采用SPSSl9.0 软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，2 组间均值的比较采用两独立样本t检验（方差齐）、3 组间均值的比较采用单因素方差分析；血清MK 和Gal-3 水平间的相关性采用Pearson 相关性分析。采用ROC 曲线确定MK 和Gal-3 诊断良恶性甲状腺结节的最佳阈值。以α=0.05 为检验水准，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DTC 患者分组情况

根据2 次治疗性131I 全身扫描结果及期间其他影像学检查结果中是否有淋巴结和（或）肺转移，将51 例DTC 术后患者分为转移阳性组和转移阴性组，其中转移阳性组8 例，包括男性2 例、女性6 例，年龄25～61（40.41±9.53）岁，具体转移部位见表1；转移阴性组43 例，包括男性10 例、女性33 例，年龄26～72（48.41±10.89）岁。

2.2 术前血清MK、Gal-3 水平在甲状腺结节良恶性组间的对比分析

甲状腺结节恶性组、良性组和健康对照组3 组间的年龄差异无统计学意义（F=0.28，P>0.05）。恶性组的血清MK 和Gal-3 水平均高于良性组及健康对照组，且差异有统计学意义（F=48.40、5.08，均P<0.05），但良性组与健康对照组间血清MK 和Gal-3 水平的差异均无统计学意义（t=−0.90、0.63，均P>0.05）（表2）。

ROC 曲线分析结果显示，MK 的最佳阈值为318.87 pg/mL、AUC 为0.91（95%CI: 0.81～0.99）、灵敏度为88.5%、特异度为78.1%；Gal-3 的最佳阈值为1.61 ng/mL、AUC 为0.72（95%CI: 0.57～0.86）、灵敏度为69.8%、特异度为70.4%（图1）。

2.3 DTC 术后首次131I 治疗前血清学指标在转移阳性组、阴性组间的对比分析

转移阳性组的血清MK 和Gal-3 水平较转移阴性组均明显升高，转移阳性组的Tg 水平明显高于转移阴性组，且差异均有统计学意义（t=−4.86～−2.89，均P<0.01）（表3）。

2.4 血清MK 和Gal-3 水平的Pearson 相关性分析

Pearson 相关性分析结果显示，甲状腺结节患者术前（r=0.67，P<0.05）及DTC 患者术后 （r=0.84，P<0.05）血清MK、Gal-3 水平之间均存在显著相关性（图2）。

表1 分化型甲状腺癌患者术后转移阳性组患者淋巴结和 （或）肺转移部位Table 1 Locations of lymph node and/or lung metastasis in differentiated thyroid carcinoma positive group

表2 2 组甲状腺结节患者和健康对照者的血清学指标比较 （ ±s）Table 2 Comparison of serological indexes among malignant, benign and healthy thyroid nodules ( ±s)

表2 2 组甲状腺结节患者和健康对照者的血清学指标比较 （ ±s）Table 2 Comparison of serological indexes among malignant, benign and healthy thyroid nodules ( ±s)

注：表中，MK：midkine；Gal-3：galectine-3

组别 MK（pg/mL） Gal-3（ng/mL）恶性组（n=23） 385.79±198.62 2.97±1.45良性组（n=18） 280.12±101.24 1.29±0.33健康对照组（n=32） 270.93±104.18 1.05±0.39 F值 48.40 5.08 P值 <0.01 0.01

表3 分化型甲状腺癌患者术后首次131I 治疗前2 组的血清 学指标比较（ ±s）Table 3 Comparison of serum indexes between 2 groups in patients after differentiated thyroid carcinoma before the first 131I treatment ( ±s)

表3 分化型甲状腺癌患者术后首次131I 治疗前2 组的血清 学指标比较（ ±s）Table 3 Comparison of serum indexes between 2 groups in patients after differentiated thyroid carcinoma before the first 131I treatment ( ±s)

注：表中，MK：midkine；Gal-3：galectine-3；Tg：甲状腺球蛋白

组别 MK（pg/mL） Gal-3（ng/mL） Tg（ng/mL）转移阳性组 （n=8）489.93±124.69 2.82±1.51 176.30±131.94转移阴性组 （n=43）277.41±115.24 1.74±0.66 15.10±14.38 t值 −4.01 −2.89 −4.86 P值 <0.01 <0.01 <0.01

3 讨论

图1 术前血清midkine（A）和galectine-3（B）水平在诊断为恶性甲状腺结节患者中的受试者工作特征曲线Fig. 1 Receiver operating characteristic curve of preoperative serum midkine (A) and serum galectine-3 (B) levels in patients diagnosed with malignant thyroid nodules

MK 是一种相对分子质量较低的蛋白质，属于分泌型肝素结合生长因子[5]，在成人体内，MK 在特定的组织或器官中低水平表达，但是当机体在遭到肿瘤细胞、炎症因子的浸润以及进行组织细胞修复时，其表达水平会明显增加[2,6]。目前的研究结果显示，MK 的生物学作用包括抗细胞凋亡、促进细胞分裂、促进血管生成和肿瘤侵袭转移等[7]。Gal-3是单基因LGALS3 编码的蛋白质，位于14 号染色体，是一种能识别糖蛋白和糖脂中特异性低聚糖结构的半乳糖结合蛋白，也称血清免疫球蛋白E 结合蛋白，其主要在细胞黏附、生长、分化及凋亡、维持细胞内稳态、促进血管生成和肿瘤侵袭转移等方面发挥作用[8]。二者在肿瘤发生发展中的作用不容忽视。

图2 甲状腺结节患者术前及DTC 患者术后血清MK、Gal-3 水平之间相关性分析的散点图 图中，MK：midkine；Gal-3：galectine-3；DTC：分化型甲状腺癌Fig. 2 Scatter plot of correlation analysis between MK and Gal-3 in patients with thyroid nodule and patients after operation of DTC

Kuzu 等[2]研究发现，在87%的恶性肿瘤中均可发现血清MK 水平升高，包括消化系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、恶性间皮瘤和乳腺癌等。Meng等[9]研究发现，甲状腺结节恶性组的血清MK 水平明显高于良性组和健康对照组，良恶性结节鉴别诊断的最佳阈值为323.12 ng/L，AUC 为0.83，诊断灵敏度和特异度分别为75.71%和75.00%。冯光勇和黄伟[10]研究发现，良恶性甲状腺结节鉴别诊断的最佳阈值为330.00 ng/mL，AUC 为0.85，诊断灵敏度和特异度分别为81.30%和78.70%。本研究结果显示，恶性组的血清MK 水平较良性组及健康对照组高，而良性组与健康对照组间的差异无统计学意义，良恶性结节组间最佳阈值为318.87 pg/mL，并有较高的灵敏度和特异度。Jing 等[11]通过对大量文献综述得出，血清MK 水平对恶性肿瘤（包括甲状腺癌）的诊断灵敏度和特异度可达78%和83%，总比值比为16.79，这表明血清MK 水平对恶性肿瘤的诊断准确性具有较强的可信性。

目前对于DTC 术后的患者，常以Tg 水平作为判断131I 疗效及甲状腺癌复发和转移的重要血清学检测指标，李田军等[12]的研究结果显示，DTC术后、首次131I 治疗前的Tg 水平升高可以预测肿瘤转移，当Tg 水平的阈值为52.75 μg/L 时，判断存在肺转移、骨转移或淋巴结转移等远处转移的灵敏度和特异度分别为78.90%和91.70%，但Tg 易受TgAb 的干扰，会在一定程度上干扰对患者病情的判断。在本研究中，转移阳性组中血清MK、Tg水平较阴性组明显升高，因转移阳性组样本量有限未能进一步筛选诊断阈值。MK 具有与Tg 相类似的评估转移灶的作用，其机制可能是因肿瘤切除后患者血清MK 的水平会明显降低，但如果DTC 发生转移或有残存转移灶，其可成为血清MK 的另一个来源，导致体内MK 水平再次升高[9]。Jee 等[13]研究得出相似结果，而Meng 等[9]研究发现，在DTC 术后患者血清MK 水平>500 ng/L 和≤500 ng/L两组中， 1 年无转移生存率分别为29.09%和94.97%，且血清MK 水平高者，1 年无转移生存率明显降低。而有关MK 在肿瘤发生发展的基础研究中发现，人体中存在多种MK 受体，包括受体酪氨酸蛋白磷酸酶ζ（PRTPζ）、间变性淋巴瘤激酶（ALK）、神经多糖C（NGC）、低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP）、蛋白多糖（SDC）、Notch、整合素和核仁素等[14]。目前研究结果表明，MK 可能通过与受体ALK 结合，使其磷酸化，进一步激活磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）及丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，使细胞凋亡受抑，细胞分裂、增殖速度加快[14]；通过间变性淋巴瘤激酶（ALK）磷酸化，激活磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B、核因子κB、酪氨酸受体激酶B 信号传导途径的各个因素，导致细胞失巢凋亡受抑制，进一步对表皮细胞生长及细胞外基质的黏附也失去抑制作用，同时也可破坏肿瘤细胞转移的生理屏障，并与受体Notch 2 结合诱导上皮间质转化，共同促进肿瘤细胞侵犯及转移[7]。

有关Gal-3 的分子机制研究结果显示，Gal-3在肿瘤的发生发展中可能通过以下几个途径来发挥作用：①通过与受体结合进一步激活磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B 信号传导通路，来达到减少线粒体膜内外电位差的目的，进而抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的活动调控细胞凋亡；②细胞凋亡刺激物被修饰为促细胞分裂素或调整细胞外基质间细胞黏附，促进细胞生长、迁徙及抑制凋亡；③通过β 连黏蛋白/Wnt 信号通路的活化促进肿瘤细胞生长加速[15]。在分子水平研究的基础上，佟杰等[16]发现，甲状腺乳头状癌高表达Gal-3，阳性率达58%～100%。在本研究中，我们检测了血清中Gal-3 的水平，结果提示恶性结节组中的Gal-3 水平明显高于良性组和健康对照组；良恶性结节鉴别的最佳阈值为1.61 ng/mL，AUC 为0.71，具有较高的诊断特异度和灵敏度（分别为70.4%和69.8%）。这与薛刚等[8]的研究结果一致。Saussez 等[17]研究了甲状腺良恶性结节中血清Gal-3 的水平，结果发现其最佳阈值为3.2 ng/mL，诊断灵敏度为73%、特异度为74%。但Dobrescu 等[18]的研究结果与上述研究不一致，他们发现，在良恶性结节中，血清Gal-3水平的差异无统计学意义，与肿瘤侵袭性也无相关性，这可能是因为其研究的样本量较上述研究少，所以结论有所不同。以上诸多研究结果显示，Gal-3水平在甲状腺结节的良恶性鉴别中可能也具有一定的诊断价值，但仍需要大样本量的研究来进一步证实。

有关血清Gal-3 水平在肿瘤转移及预后的作用在结直肠癌等的相关研究中也有所体现[19]，而在对DTC 的研究中，也有学者得出与本研究类似的结果：转移阳性组中血清Gal-3 水平明显高于阴性组[20]。相关研究结果显示，与淋巴结转移阴性组对比，转移阳性组中DTC 患者血清中Gal-3 水平的表达量明显增高，并可根据Gal-3 水平表达的高低来初步判断甲状腺癌是否有转移灶的存在；血清Gal-3 水平与肿瘤分期呈正相关，分期越高，血清中Gal-3 的水平越高[21]。而其中分子机制可能是Gal-3 通过在低氧环境中促进上皮间充质化，再进一步激活磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B 信号传导通路以及丝裂素活化蛋白激酶、β 连黏蛋白/Wnt和Src/黏着斑激酶信号通路这一途径来实现细胞转移[22]。

本研究结果发现，血清中MK 和Gal-3 水平对甲状腺良恶性结节的诊断有一定临床价值，并且对评估DTC 术后是否还存在转移灶也有一定的意义。此外，我们还发现，血清MK 与Gal-3 之间有明显的相关性，这可能与两者在甲状腺癌中的分子机制有一定相关性，有待进一步深入研究。但本研究中的样本量有限（特别是转移阳性组与阴性组），未能将血清MK、Gal-3 水平分别与Tg 水平进行对比研究，另外随访日期较短，缺少对患者远期预后的评估，日后将进一步增加样本量，延长随访时间，更深一步地探索、求证两者在甲状腺疾病诊断中的应用价值。

利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。

作者贡献声明 武晨负责研究方案的设计与实施、数据的采集与统计分析、论文的撰写；杜芬负责研究方案的实施、数据的采集、统计分析与指导；刘师伟、马浩华负责数据的采集、论文撰写的指导；张海涛负责数据的采集、技术支持；刘静负责研究方案的实施、数据的采集；张迎伟负责数据的分析与指导；罗丽萍负责协助研究的进行、数据的采集与分析；程艳负责研究命题的提出、论文的审阅。