红叶石楠耐铅内生细菌的分离及其16S rDNA鉴定

黄雅丽 ，赖安萍 ，侯柚银 ，张华峰 ，刘希华

（1.三明学院资源与化工学院，福建 三明 365004；2.福建省矿山生态修复工程技术研究中心，福建 三明 365004；3.厦门市森林病虫害防治技术站，福建 厦门 361004）

我国作为一个矿产资源相对丰富的国家，矿产资源大量利用促进了国民经济的快速发展，同时因矿产资源的开发利用而产生了生态环境问题。重金属污染具有隐蔽性和高额治理成本等特点，特别是对土壤的污染具有不可逆的作用，并通过植物和作物产品转接到人类的食物链环节，由此引起重金属对人类的毒害。从2018年福建省环保厅下发文件《福建省涉重金属行业污染防控工作方案》中提及，在所有福建省的重点污染物中，铅位居5种重金属污染之首。在修复重金属污染土壤的技术中，化学、物理和生物修复这三种方法最为有效，前两者或存在产生二次污染，或者费用高等缺点，生物修复技术则避开了上述两种修复方法的缺点，特别是微生物和植物联合修复重金属污染土壤，这种方法克服了受铅胁迫的植物生长缓慢以及吸附的重金属难以从土壤中除去等缺点，其修复效果逐步受到科学工作者的认可[1-3]。

红叶石楠（Photinia serrulata）是福建地区常见的小乔木或灌木，新梢和新叶为鲜红色，且不受环境中铅离子的毒害，目前作为公路街道路旁的行道树而大量种植[4]。但由于红叶石楠生物量较小，不适合于矿山等大面积铅污染的修复，因此从耐铅的植物上分离纯化出耐铅的内生细菌，并接种到乔木上，从而选育出适合矿山种植的树种，以达到修复矿山等大面积铅污染土壤的目的。

关于耐铅的内生细菌的研究鲜有报道，仅本课题组从小飞蓬(Conyza canadensis)和龙葵(Solanum nigrum)等草本植物上成功分离出耐铅的内生细菌[5-6]，但由于草本植物多为一年本植物，且没有木本植物的高大树干，因此，无法确定分离出来的内生细菌能否成功殖在木本植物。有研究表明，内生细菌与宿主植物组织表面的亲和机制如何,可能会影响到内生细菌侵染宿主植物的效率，并可能是影响内生细菌共生特异性的因素[7]。还有研究表明，许多的植物内生细菌具有宿主专一性特点，同一植物不同品种因环境或其他原因，也具有不同种类的内生细菌，同种内生细菌定殖寄主体内和促进寄主的生长的能力，也可能因同种植物不同的品种而有所差异[8]。基于此，本研究期望从耐铅的小乔木红叶石楠上分离纯化出耐铅的内生细菌，为成功定殖在木本植物体内并提高其耐铅的能力打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与方法

1.1.1 红叶石楠

取自栽种于三明学院校门G205国道两侧绿化带中红叶石楠根茎叶3个部位，由于此路段有大量重型汽车行驶经过且车流量较大，且汽车尾气中的主要成分是含铅化合物，所以此路段土壤在受到到汽车尾气的长期污染下已存在铅重金属污染，而栽种的植株必定受到一定程度的铅胁迫。

1.1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨固体培养基，其中铅离子浓度依次为 0、0.3、0.6、0.9、1.2 mol/mL[6]。

1.2 内生细菌的分离和纯化

红叶石楠内生细菌的分离方法参照本课题组小飞蓬耐铅内生细菌的分离方法[6]。

1.3 形态及生理生化鉴定

对分离纯化的菌株进行柠檬酸盐反应、VP试验、革兰氏染色、甲基红试验和接触酶反应等检验[6]。

1.4 分子鉴定

菌株基因组DNA用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒V2.2进行提取，以通用引物8f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和 1492r（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）（上海华大基因）进行PCR扩增。退火温度为52℃。PCR产物为1 800 bp左右，用pMD19-T Vector连接PCR产物，挑取阳性克隆质粒，送往杭州有康生物科技有限公司测序[6]。

测序后的序列在NCBI核酸数据库，BLAST比对分析，用Clustal X 1.83对同源性超过95%序列进行分析，用软件 MEGA（7.0）利用 Neighbor-Joining（NJ）法构建系统进化发育树[9]。

2 结果与讨论

2.1 内生菌的分离与纯化

红叶石楠表面灭菌处理的最后一遍无菌水涂布检测分析，7 d后，没有长出菌落，说明外植体表面消毒干净。从不同铅浓度的培养基上分离得到的细菌为内生细菌，共分离纯化出44株内生细菌，其中在根、茎、叶的部位分别分离出17株、16株和11株（表 1）。

表1 红叶石楠分离菌株情况

2.2 形态学与耐铅生理浓度检测

菌落为圆形，边缘无锯齿状，乳白色，表面光滑。经显微镜观察，所有菌株革兰氏染色结果均为G+菌，其菌株形态为杆状和球状。淀粉水解酶实验的结果都为阳性（+），40株甲基红试验测定结果为阴性（-），39株菌 VP试验结果为阳性（+），40株过氧化氢酶结果为阳性（+）（表2）。

表2 生理生化结果

2.3 内生细菌16S rDNA分子鉴定

根据细菌的形状、甲基红试验、VP试验结果和过氧化氢实验结果，提取S5、S11、S12、S13、S15、S16、S17、S22、S25和S43这些内生细菌的DNA，扩增各自的16S rDNA序列，并送去测序。测序分析结果表明，这些内生细菌16SrDNA序列有3种，其中，S43为一种菌，S5、S12、S13和S25的16S rDNA序列相同，S11、S15、S16、S17和S22的16SrDNA序列相同。将这3段16S rDNA序列上传到NCBI数据库，收集同源性高的序列。

利用MEGA（7.0）将红叶石楠内生细菌菌株与其同源性较高的菌株16S rDNA序列构建系统进化发育树 （图1）。从不同菌株的遗传距离上进行比较分析，初步推断出S5为假单胞菌属(Pseudomonas)，S17为蜡样芽孢杆菌属(Bacillus cereus)，S43为不动杆菌属(Acinetobacter)。

2.4 讨论

生长在重金属污染的地区植物，随着人类和动物的取食，积累在植物体内的重金属也会随之进入人类体内，进而危害人类的健康[10]。因此在重金属污染的土壤修复过程中，应避免可食用的植物如蔬菜和一些易被动物食用的草本植物用于重金属污染土壤生物修复。大部分木本植物因为其不进入食物链，在植物修复重金属污染过程中将发挥重要的角色。

微生物与植物的共生关系促进植物在铅胁迫的条件下生长的现象，在小白菜[11]、扁豆[12]等植物上也有发现相类似情况。芽孢杆菌属能帮助植物在重金属离子胁迫下，产生生长激素如IAA等[13]，以利于植物生长。芽孢杆菌属能帮助小白菜在铅胁迫下，减少Pb的吸附量，以提高叶绿素含量，促进植物生长[11]。不动杆菌和假单胞菌属在Pb的胁迫下能产生出IAA等生长素，在植物某个部位、组织或结构中生长素含量越多，对植物生长和吸收重金属便越有利[14-16]。芽孢杆菌属和假单胞菌属可以溶解土壤中有机磷，促进植物对磷的吸收[17]；假单胞菌属具有ACC脱氨酶，能够阻止植物产生乙烯，可以促进植物根的生长[18]。因此推断出这些内生细菌与红叶石楠的共生关系在一定程度上能防止铅离子对其的伤害。

图1 基于16S rDNA基因序列构建的红叶石楠内生细菌系统发育树

3 结论

本研究是以红叶石楠根茎叶在含有不同铅离子浓度的培养基中分离出耐铅内生细菌，共分离出44株耐铅的内生细菌，对所分离的菌株进行生理生化分析，并通过16S rDNA序列的遗传距离聚类分析等分子鉴定相结合的方法，将这些菌株分别归为假单胞菌属、蜡样芽孢杆菌属和不动杆菌属。本研究为铅污染地区土壤的微生物与植物联合的生物修复提供了行之有效的技术理论基础。