miR-221/ 222 靶向抑制对三阴性乳腺癌MDA-MB-231 细胞顺铂敏感性的影响

叶惠荣 袁惠玲 曹 茵 王西跃 吴丽华 陈桂林 陈丽娟 张玉娟

广东省东莞市人民医院乳腺科，广东东莞 523000

微RNA（miR）-221/222 定位于人染色体Xp11.3[1]，两者核心种子序列（68～72）完全同源，同时抑制miR-221/222 可抑制乳腺癌[2-3]、胶质瘤[4-5]等肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。研究显示[6]，耐药乳腺癌组织中miR-221/222 表达上调，但抑制miR-221/222 是否可增加三阴性乳腺癌（TNBC）的铂类药物敏感性目前较少见报道。鉴于此，本研究观察了抑制miR-221/222 对TNBC MDA-MB-231 细胞顺铂（DDP）敏感性的影响，现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

细胞株：TNBC MDA-MB-231 细胞购自美国模式菌种收集中心（ATCC）细胞库，编号：TCHU202，第2 代细胞。

试剂：miR-221 抑制剂、miR-222 抑制剂和miR-221/222 抑制剂（上海吉玛制药技术有限公司，货号：B05001）；MTT 检测试剂盒（美国Trevigen 公司，货号：4890-25-01）；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒（大连美仑生物技术有限公司，货号：MA0220）；Caspase-9、Bax、Bcl-2 一抗（美国Imgenex 公司，IMG-5709）。

仪器：GENios 多功能酶标仪（瑞士TECAN 公司）；7900HT 实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国ABI 公司）；E10001 电泳槽（美国Invitrogen 公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组和转染 取对数生长期的MDA-MB-231 细胞，将其随机分为对照组、miR-221 抑制组、miR-222 抑制组和miR-221/222 抑制组，分别转染空白试剂、miR-221 抑制剂、miR-222 抑制剂和miR-221/222 抑制剂，转染后均给予DDP 5 μg/mL 进行细胞培养[7]。

1.2.2 荧光定量PCR 检测miR-221/222 mRNA 相对表达量 转染后24 h 时用Trizol 提取各组细胞的总RNA，采用荧光定量PCR 法检测各组MDA-MB-231细胞中miR-221/222 mRNA 的相对表达量，miR-221上 游：3’-ACACTCCAGCTGGGACCTTGGCATACA -ATGT-5’，下游：3’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAATCT-5’；miR-222 上游：3’-ACACTCCAGCTGGGAGCTACATCTGGCTA-5’，下游：3’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCCAG-5’；以U6 为内参（上游：3’-CTCGCTTCGGCAGCACA-5’，下游：3’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5’），逆转录反应操作均按照Takara036A（mRNA）/037A（micro RNA）公司逆转录试剂盒说明书进行，反应体系：SYBR®Premix Ex TaqTM（2×）5.0 μL，Forward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×） 0.2 μL，DNA 模板（上述逆转录产物）1.0 μL，dH2O 2.8 μL，Total 10.0 μL，反应体系20.0 μL，扩增条件37℃15 min，85℃5 s，4℃1 min，共40 个循环，反应终止后，将样本取出，-80℃冰箱内保存备用。采用2-ΔΔCt法分析计算[8]。

1.2.3 MTT 法检测细增殖抑制率 转染后24、48 h 时取各组细胞，采用MTT 法检测各组细胞吸光度（OD490）值，将孔板进行染色，每孔加20 μL MTT（5 mg/mL），常规培养4 h 弃孔内液体，每孔加入150 μL DMSO 溶解，摇床10 min 混匀，490 nm 波长在酶联免疫检测仪上测各孔的OD 值，实验重复3 次，计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=（1-处理组A/对照组A）×100%[9]。

1.2.4 Annexin V-FTTC/PI 双染法检测细胞凋亡率转染后24、48 h 时取各组生长状态良好、密度在85%以上、贴壁完好的细胞，常规6 孔板接种，CO2培养箱37℃培养24 h，弃培养液，PBS 洗涤，0.25%胰酶消化细胞后加完全培养基，离心弃上清，PBS 重悬计数，离心弃上清，加Binding Buffer 悬浮细胞，加入V-FTTC 5 μL、PI 10 μL 避光5 min 以上后，进行流式细胞检测[10]。

1.2.5 蛋白质印迹法检查凋亡相关蛋白表达水平 转染后48 h 时取各组细胞，裂解后采用蛋白质印迹法检测各组Caspase-9、Bax、Bcl-2 蛋白表达水平：PBS清洗细胞，加RI-PA 进行裂解，蛋白电泳后湿转法转移蛋白至PVDF 膜，加Caspase-9、Bax、Bcl-2 蛋白抗体4℃孵育过夜，TBST 洗涤后孵育二抗，随后化学发光成像仪显影。以GAPDH 为内参，计算相对表达量[11]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析进行检验，进一步两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组miR-221/222 mRNA 相对表达量比较

各组间miR-221、miR-222 mRNA 相对表达量比较，差异均有统计学意义（P ＜0.05）；进一步两两分析显示，miR-221 抑制组miR-221 mRNA 表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；miR-222 抑制组miR-221 mRNA 表达水平高于miR-221 抑制组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；miR-221/222 抑制组miR-221 mRNA 表达水平低于miR-222 抑制组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。miR-221 抑制组与对照组miR-222 mRNA 表达水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；miR-222 抑制组和miR-221/222 抑制组miR-222 mRNA 表达水平低于miR-221 抑制组和对照组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表1。

表1 各组miR-221/222 mRNA 相对表达量比较（，n=6）

表1 各组miR-221/222 mRNA 相对表达量比较（，n=6）

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与miR-221 抑制组比较，#P ＜0.05；与miR-222 抑制组比较，ΔP ＜0.05

2.2 各组细胞增殖抑制率比较

各组转染后24、48 h 的细胞增殖抑制率比较，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）；进一步两两比较显示，miR-221 抑制组与对照组转染后24、48 h 的细胞增殖抑制率比较，差异均无统计学意义（均P ＞0.05）；miR-222 抑制组与miR-221 抑制组转染后24、48 h细胞增殖抑制率比较，差异均无统计学意义（均P ＞0.05）；miR-221/222 抑制组转染后24、48 h 细胞增殖抑制率高于其余三组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞增殖抑制率比较（%，，n=6）

表2 各组细胞增殖抑制率比较（%，，n=6）

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与miR-221 抑制组比较，#P ＜0.05；与miR-222 抑制组比较，ΔP ＜0.05

2.3 各组细胞凋亡情况比较

各组转染后24、48 h 的细胞凋亡率比较，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）；miR-221 抑制组与对照组转染后24、48 h 细胞凋亡率比较，差异均无统计学意义（均P ＞0.05）；miR-222 抑制组与miR-221 抑制组转染后24、48 h 细胞凋亡率比较，差异均无统计学意义（均P ＞0.05）；miR-221/222 抑制组转染后24、48 h 细胞凋亡率高于其余三组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表3。

2.4 各组细胞凋亡相关蛋白相对表达水平比较

转染后48 h，各组间Caspase-9、Bcl-2 和Bax 表达水平比较，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）；进一步两两比较，miR-221 抑制组与对照组转染后48 h的细胞凋亡蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（均P ＞0.05）；miR-222 抑制组与miR-221 抑制组转染后48 h 的细胞凋亡蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（均P ＞0.05）；miR-221/222 抑制组转染后48 h 的Caspase-9 和Bax 水平高于其余三组，Bcl-2水平低于其余三组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表4、图1。

表3 各组细胞凋亡情况比较（%，，n=6）

表3 各组细胞凋亡情况比较（%，，n=6）

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与miR-221 抑制组比较，#P ＜0.05；与miR-222 抑制组比较，ΔP ＜0.05

表4 各组细胞凋亡相关蛋白相对表达水平比较（，n=6）

表4 各组细胞凋亡相关蛋白相对表达水平比较（，n=6）

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与miR-221 抑制组比较，#P ＜0.05；与miR-222 抑制组比较，ΔP ＜0.05

图1 蛋白质印迹法检查凋亡相关蛋白相对表达水平

3 讨论

乳腺癌是导致全球女性癌症相关死亡的重要因素，虽然手术为主的综合治疗方式取得了进展，患者5 年和10 年生存率不断提高，但复发和转移仍是影响乳腺癌患者10 年生存率不高的重大挑战，癌细胞对化疗的耐药性是导致乳腺癌复发和转移的主要原因之一。TNBC 是雌激素受体（ER）阴性、孕激素受体阴性和人类表皮生长因子受体2 阴性为免疫组化特征的乳腺癌亚型，占乳腺癌总数的10%～20%。与其他亚型比较，TNBC 恶性程度高、侵袭性强、预后较差，因为缺乏激素治疗的典型靶向受体，铂类药物是治疗TNBC 的常用化疗药物。DDP 是治疗TNBC 的常用化疗药物，DDP 耐药是导致TNBC 化疗失败的重要因素[12-15]。DDP 诱发肿瘤细胞DNA 损伤和细胞凋亡的同时，能激活DNA 修复系统，诱导核苷酸的切除修复和同源重组，进而导致细胞对DDP 产生耐药性，降低DNA 修复能力可增加肿瘤细胞的DDP 敏感性[16-19]。

TNBC 对铂类化疗的敏感性与基因组不稳定性之间存在相关性。miRNAs 是一类非编码的小RNA，参与包括肿瘤在内的多种生物学过程，通过3’非翻译区（3’UTR）碱基配对抑制靶基因mRNAs 的基因翻译和/或切割调控靶基因的表达，促进肿瘤的进展和耐药。miR-221/222 是位于X 染色体的miRNA 簇，既往研究显示[20]，miR-221/222 在前列腺癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤中表达，并发挥癌基因的作用。近年来的研究显示[21]，miR-221/222 除扮演癌基因角色外，还可影响肿瘤的耐药性。有研究显示，在脑胶质瘤中单纯抑制miR-221 可增加卡莫司汀的耐药性[22-24]，乳腺癌MCF7 细胞单纯转染miR-221 后导致对选择性ER 下调剂氟维司群的耐药性增加[25]。但miR-221/222 与TNBC DDP 耐药的研究鲜见报道，尚需要进一步研究探讨。为了探讨miR-221/222 与TNBC DDP 耐药的关系，本研究采用荧光定量PCR 法检测了miR-221/222转染后DDP 培养的MDA-MB-231 细胞中miR-221和miR-222 的表达，结果显示，通过抑制miR-221、miR-222 及共抑制miR-221/22 后，MDA-MB-231 细胞中相应的miR-221/222 mRNA 表达减少，但单纯抑制miR-221 和miR-222 并未明显改变MDA-MB-231 细胞的增殖率和凋亡率，而共抑制miR-221/222可明显降低细胞的增殖率和凋亡率，蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白进一步证实了上述结果。本研究结果显示，miR-221/222 可促进TNBC MDA-MB-231 细胞对DDP 的耐药性，抑制miR-221/222 可增加MDAMB-231 细胞对DDP 的敏感性。

综上所述，本研究结果显示，miR-221/222 可调控TNBC 细胞的DDP 耐药性，为DDP 联合小分子非编码RNA 治疗TNBC 提供了新的研究方向。