糖皮质激素对高氧诱导的新生小鼠肺功能损伤、炎症反应和JAK2/STAT5通路的影响*

刘 露 冯 伟 郭轶男

(沈阳市第四人民医院重症医学科，沈阳 110031)

支气管肺发育不良 (bronchopulmonary dysplasia, BPD) 是多发于早产儿的慢性呼吸系统疾病。由于早产儿各器官、系统未完全发育，BPD的发病率随孕龄和胎儿出生体质量的减少而增加[1-2]。补充高浓度氧气、感染、炎症、机械通气以及遗传因素都是诱发BPD的重要原因[3-5]。糖皮质激素 (Glucocorticoid, Gluc) 具有抗炎、抗过敏、免疫抑制、抗微生物毒素和抗休克等作用，可促进肺泡Ⅱ型细胞成熟和肺表面活性物质产生[6-7]。有研究显示糖皮质激素可通过调节 JAK2/STAT5 信号抑制小鼠气道重塑平滑肌细胞的增殖作用, 而气道重塑指气道在炎症刺激下发生的气道壁增厚，细胞外基质沉淀等。JAK2/STAT5 信号通路可介导机体炎症反应，并参与调控细胞凋亡、增殖与分化[8-10]，因此，我们猜测JAK2/STAT5 通路的激活可能与糖皮质激素缓解小鼠肺功能损伤有关。本研究旨在通过研究糖皮质激素对高氧诱导的小鼠肺脏炎症反应、肺功能损伤及对JAK2/STAT5 通路的影响，为治疗肺功能损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

30只新生一日龄SPF级C57BL/6 小鼠购自重庆医科大学实验动物中心，雌雄不限，许可证号[SYXK (渝) 2017-0023]；地塞米松购自中国食品药品检定研究院；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、RIPA裂解液购自碧云天公司；反转录试剂盒、PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，IL-6、 MCP-1、 iNOS检测试剂盒均购自Abcam公司；本研究所用抗体均购自CST公司；引物由北京华大基因公司合成。细胞培养箱购自美国Thermo公司；PCR 仪、垂直电泳槽购自美国Bio-Rad公司；AniRes2005 动物肺功能分析系统购自北京贝兰博科技公司。

1.2 试验动物处理及分组

将新生小鼠随机分为对照组、Hyperoxia组、低剂量 Gluc组(Hyperoxia+ 1.2 mg/kg体质量 Gluc)、中剂量Gluc组(Hyperoxia+2.4 mg/kg体质量 Gluc)、高剂量Gluc组(Hyperoxia+4.8 mg/kg体质量 Gluc)，每组6只。将各组小鼠饲养于相同的氧箱中，对照组小鼠供应正常空气，造模小鼠均提供浓度 ≥ 90%的氧气，连续饲养7 d。低、中、高剂量 Gluc组于造模后进行尾静脉注射地塞米松(1 mg/kg)，2天1次，共3次。对照组与Hyperoxia组仅需注射等体积生理盐水即可。

1.3 肺功能检测

使用1%戊巴比妥钠进行腹腔注射，小鼠麻醉后行气管切开术。将小鼠仰卧放置于体描箱并记录静息呼吸状态，连接呼吸机后连续检测各组小鼠静息通气量、气道阻力、气道压力、肺容积、最大吸气流量5次，取平均值。

1.4 石蜡切片及HE染色

将各组小鼠颈椎脱臼处死后，取出肺脏浸泡于4%多聚甲醛中固定，按照常规方法制作石蜡切片。将切片在二甲苯中脱蜡，再经梯度酒精水化。根据HE染色试剂盒说明书进行染色，经中性树胶封固后在显微镜下观察。

1.5 TUNEL染色检测肺组织的细胞凋亡

将肺组织石蜡切片进行脱蜡、水化，并按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒程序进行操作，封片后显微镜下观察。

1.6 RT-PCR检测

Trizol法提取总RNA，按反转录试剂盒说明书合成cDNA。β-actin引物：上游5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′，下游5′-ATGGAGCCACC GATCCACA-3′；TGF-β引物：上游5′-ATAC GCCTGAGTGGCTGTCTTT-3′，下游5′-AAAGCCCTGTATTCCGTCTCC-3′；α-SMA引物：上游5′-GCCAAGCAC TGTCAGGAATCC-3′，下游5′-CACAATGG ATGGGAAAACAGCC-3′。扩增条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40个循环。

1.7 Western Blot检测

将肺组织充分匀浆，每20 mg组织加入150 μL的RIPA裂解液。蛋白上清中加入loading buffer并经沸水加热变性，经电泳分离蛋白后转印蛋白质至PVDF膜，5% 脱脂牛奶室温封闭2 h，分别孵育一抗、二抗，PBST洗脱后，加入BCL，进行曝光，用ImageJ软件对蛋白质条带灰度值进行分析。

1.8 ELISA检测

将各组小鼠颈椎脱臼处死后，结扎靠近鼻腔端的气管和右肺，从气管处向右肺内注入3 mL PBS，充分灌洗后回收支气管肺泡灌洗液至离心管，将灌洗液1 000 r/min离心5 min，取上清。用ELISA试剂盒分别检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-6、 MCP-1、 iNOS的含量。

1.9 白细胞计数

同上取得各组小鼠的支气管肺泡灌洗液，将灌洗液1 000 r/min离心5 min，弃上清。取500 μL PBS重悬细胞，充分混匀后取10 μL滴加至细胞计数板，分别计数嗜酸性粒细胞和白细胞。

1.10 统计方法

2 结果

2.1 糖皮质激素缓解高氧诱导的小鼠肺功能下降

使用动物肺功能分析系统检测小鼠肺功能。如图1所示，与对照组相比，Hyperoxia组、低剂量 Gluc组中小鼠的静息通气量、气道阻力、气道压力、肺容积、最大吸气流量均显著降低(P<0.05)。其次，与对照组相比，中剂量Gluc组静息通气量、气道压力、肺容积、最大吸气流量均显著下降 (P<0.05)，而气道阻力无显著变化。与Hyperoxia组相比，中、高剂量Gluc组中小鼠各肺功能指标均显著升高(P<0.05)。

2.2 糖皮质激素缓解高氧诱导的小鼠肺组织损伤

通过HE染色和TUNEL染色观察各组小鼠肺组织形态及凋亡情况。如图2-A所示，对照组新生小鼠肺泡结构规整，肺泡间隔无炎症细胞浸润；Hyperoxia组小鼠肺实质结构紊乱，肺泡腔内可见坏死细胞、炎性细胞、红细胞，肺泡间隔增宽且有大量炎症细胞浸润；低、中、高剂量 Gluc组小鼠肺实质结构改变程度逐渐降低。

图1 糖皮质激素对模型小鼠肺功能的影响

图2 糖皮质激素对模型小鼠肺组织形态及细胞凋亡的影响

如图2-A和2-B所示，与对照组相比，Hyperoxia组、低、中剂量Gluc组中凋亡细胞数均显著增多 (P<0.05)。与Hyperoxia组相比，中、高剂量Gluc组中细胞凋亡数量显著减少 (P<0.05)。由此可见，糖皮质激素可以减轻高氧诱导的小鼠肺组织损伤。

2.3 糖皮质激素抑制高氧诱导的小鼠肺组织纤维化

通过RT-PCR、Western Blot检测α-SMA、TGF-β表达水平。如图3所示，与对照组相比，Hyperoxia组、低、中剂量Gluc组中α-SMA， TGF-β在mRNA和蛋白水平的表达量均显著增加 (P<0.05)；与Hyperoxia组相比，中、高剂量Gluc组中α-SMA， TGF-β在mRNA和蛋白水平均显著下降(P<0.05)。提示，糖皮质激素可下调模型小鼠肺组织中肺纤维化标记物α-SMA、TGF-β的表达。

2.4 糖皮质激素缓解模型小鼠肺脏中炎症反应

收集小鼠支气管肺泡灌洗液，统计嗜酸性粒细胞占白细胞总数的百分比。如图4-A所示，与对照组相比，Hyperoxia组、低、中剂量Gluc组中嗜酸性粒细胞占比显著升高 (P<0.05)；与Hyperoxia组相比，中、高剂量Gluc组中嗜酸性粒细胞占比均显著下降 (P<0.05)。ELISA检测灌洗液中IL-6、 MCP-1、 iNOS的含量。如图4-B～4-D所示，与对照组相比，Hyperoxia组、低、中剂量Gluc组中IL-6、 MCP-1、 iNOS的含量均显著增高 (P<0.05)；与Hyperoxia组相比，中、高剂量Gluc组中IL-6、 MCP-1、 iNOS的含量均显著下降 (P<0.05)。由此可见，糖皮质激素可缓解高氧诱导的小鼠肺组织中的炎症反应。

通过Western Blot检测JAK2和STAT5的磷酸化情况。如图5所示，与对照组相比，Hyperoxia组、低、中剂量Gluc组中p-JAK2/JAK2、p-STAT5/STAT5比例均显著增高 (P<0.05)；与Hyperoxia组相比，高剂量Gluc组中p-JAK2/JAK2、p-STAT5/STAT5比例均显著下降 (P< 0.05)。由此可见，糖皮质激素模型小鼠组织中JAK2/STAT5通路活性。

图3 糖皮质激素对模型小鼠肺纤维化的影响

图4 糖皮质激素对模型小鼠肺脏炎症反应的影响

图5 糖皮质激素对JAK2和STAT5蛋白磷酸化的影响

3 讨论

目前，对于BPD的治疗依旧是个难题。有报道称，糖皮质激素具有抗炎、抗过敏、抗休克等作用。因此，糖皮质激素有望成为BPD的治疗药物。

高氧是诱导肺功能损伤的重要原因。有研究表明，持续性高氧可诱导小鼠的肺泡容积、肺容量显著增加，而肺泡表面积、肺微血管容量显著减少[11]，这提示，高氧可降低功能性肺泡-毛细管气体扩散效率。还有研究显示，高氧诱导早产幼兔气道阻力和总肺活量下降，而增加肺组织弹性和组织阻尼[12]，造成肺功能低下。本研究结果显示，高氧处理诱导新生小鼠静息通气量、气道阻力、气道压力、肺容积、最大吸气流量降低，而糖皮质激素可缓解高氧对小鼠肺功能的影响所用。

在高氧作用下，肺脏组织发生病理性变化。有相关研究显示，高氧导致早产幼兔肺泡数量减少且肺泡腔变大，肺泡壁增厚，远端气道减少，且炎性细胞浸润增多[13]。此外，Luan等人通过径向肺泡计数 (RAC) 评估肺泡发育程度发现暴露于高氧的新生小鼠肺组织中肺泡数量明显减少，同时高氧还诱导I型胶原 (COL1)、MMP-9、TIMP-1、α-SMA、TGF-β的表达水平升高，促进小鼠肺组织的纤维化[14]。肺纤维化是各种间质性肺疾病的最终病理表现，而上皮细胞间质转化在其中发挥重要作用[15]。在EMT过程中，E-钙粘素 (E-Cadherin)表达量降低，间质细胞标记物 α-SMA 表达量增加，最终使得细胞增殖和迁移能力增强[16-17]。在本研究中，Hyperoxia组小鼠肺实质结构紊乱，肺泡腔内可见坏死细胞、红细胞，肺泡间隔增宽且有大量炎症细胞浸润，TUNEL染色发现大量细胞凋亡；而糖皮质激素可以缓解高氧诱导的小鼠肺组织形态改变，并减少凋亡细胞数量。此外，糖皮质激素可逆转高氧诱导的小鼠肺组织中肺纤维化标记物α-SMA， TGF-β的表达量增加，抑制肺组织的进一步损伤。

炎症反应是机体的正常保护性反应，而过度的炎症反应会加重细胞和组织损伤。目前已有大量的研究证实高氧诱导的肺功能损伤与肺内的炎症有关。Jin等发现，高氧处理的早产小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平升高，且肺组织中细胞凋亡数量增多[18]。Kumar等发现，高氧诱导小鼠肺脏中炎症标志物MCP-1，IL-12，INF-γ含量增高，且肺泡灌洗液中淋巴细胞数量增加[19]。嗜酸性粒细胞主要存在于组织中，当发生间质性肺炎或支气管哮喘等疾病时会出现嗜酸性粒细胞增高的现象[20-21]。本研究结果显示，糖皮质激素可以逆转高氧诱导的小鼠肺脏中嗜酸性粒细胞增多和炎症因子IL-6、 MCP-1、 iNOS含量增加，这提示糖皮质激素可有效缓解高氧损伤所造成的肺脏炎症反应。

JAKS家族是一类非受体型酪氨酸蛋白激酶，而信号传导及转录激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)可被JAK磷酸化而发生二聚化，参与基因表达调控。JAK/STAT通路是细胞信号转导的重要途径之一，参与调控机体炎症反应、细胞增殖、凋亡、分化等多个方面[22]。有研究表明，糖皮质激素可通过抑制JAK2/STAT5通路缓解小鼠支气管胶原沉积、气道重塑，并降低嗜酸性粒细胞占白细胞的比例[8]。而气道重塑指气道在炎症刺激下发生的气道壁增厚，细胞外基质沉淀等。在本研究中，我们发现糖皮质激素可以抑制高氧诱导的小鼠肺组织中JAK2/STAT5通路磷酸化水平升高。这提示，JAK2/STAT5通路高度磷酸化可能与高氧诱导的肺组织损伤及炎症有关，而糖皮质激素可能通过抑制该通路活性而缓解小鼠的肺损伤。

综上所述，糖皮质激素可缓解肺组织损伤并下调模型小鼠肺脏组织中炎症因子含量，同时抑制JAK2/STAT5通路活性。下一步我们将深入探究JAK2/STAT5通路活性与糖皮质激素作用的关系，进一步探究糖皮质激素缓解肺功能损伤的分子机制。