应用微卫星技术分析评价虎皮猫群体的遗传质量*

王 洪 付 瑞 魏 杰 贾松华 光娇娜 马丽颖 岳秉飞

(中国食品药品检定研究院，北京 102629)

实验动物是支撑生物医学研究发展的基础学科，保证实验动物的质量是保障我国科研工作质量的重要前提。实验动物同科学仪器和科学试剂一样，不仅需要进行标准化生产，而且需要对其进行质量控制，这是实验动物与非实验动物的重要差别。实验动物的质量控制包括遗传质量控制，微生物质量控制，营养和环境质量控制等很多方面。其中，实验动物的遗传质量关乎动物实验结果的重复性和可信性，甚至决定科研项目的方向和成败。因为实验动物本身的特殊性，在动物的饲养和繁育过程中，遗传漂变会不可避免地发生，遗传漂变的不断累积，将会导致实验动物遗传结构和遗传背景的改变，进而影响科研工作的实验结果。如何最大限度地控制遗传漂变，保证实验结果的可重复性：一方面，应采取科学规范的饲养繁育方式；另一方面，应定期对实验动物开展遗传质量检测。

分子标记是评价群体遗传多样性的工具。实验动物的遗传质量控制手段包括生化标记检测法，微卫星DNA标记检测法等[1]，其中，微卫星方法是国际通用的实验动物遗传质量控制技术。微卫星是广泛存在于真核生物基因组中的短串联重复序列，核心序列为2～6个bp。不同动物个体的核心序列重复次数不同，通过PCR、电泳和测序等多种技术手段识别不同动物微卫星片段的差异，从而形成不同品系和不同群体所特有的遗传背景和遗传结构。实验动物的遗传结构信息可以作为该品系遗传质量评价的标准依据，同时亦可为动物实验结果的可靠性提供保证。

实验用猫是眼科疾病斜视弱视动物模型，在降压物质检查试验中不可或缺[2-3]。本研究中的虎皮猫是华北制药厂于二十世纪七十年代末开始培育的我国特有的实验用猫[4]。该群体是我国历史最悠久的实验用猫群体，亦是我国最早作为实验用动物应用于生物医学研究中的实验猫。目前，关于实验用猫群体遗传多样性的研究资料甚少，随着我国实验动物标准化体系的不断完善，实验用猫的遗传质量控制标准即将发布。为保证虎皮猫群体的遗传质量，本研究中，利用37个微卫星位点对该虎皮猫群体的25只动物的DNA样本进行遗传质量分析评价，旨在为虎皮猫群体在生物医药领域的应用提供质量保证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：本研究使用的虎皮猫血液样本由华北制药厂提供，成年虎皮猫的数量是25只。实验用猫经舒泰麻醉，前肢采集血液入抗凝管，4 ℃保存备用。

1.1.2仪器和试剂：电泳仪Bio-Rad POWERPAR BASIC，DNA微量分析仪NanoPhotometer，PCR扩增仪ABI VeritiTM 96，凝胶成像分析系统GelLogic 212Pro。

DNA marker，Taq 酶，dNTP和10×PCR buffer由Takara提供。ExRed 核酸染料，购自庄盟生物。

1.2 方法

1.2.1虎皮猫基因组DNA提取：依据《分子克隆指南》，采用NaI方法提取基因组DNA[5-6]。利用DNA微量分析仪测定基因组DNA浓度，DNA工作液浓度为50～100 ng/μL，保存于4 ℃备用。

1.2.2微卫星位点选择和引物合成：基于本课题组的前期研究成果，选择37个有效扩增微卫星位点，[4]引物合成由上海生工有限公司完成。

1.2.3PCR和电泳[7]：PCR反应体系包括：10×buffer(含Mg2+)2 μL，dNTP(A,C,T,G各2.5 mmoL/L)1 μL，上下游引物(100 μmoL/L)各1 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA模板(50-100 ng/μL)1 μL，无菌水13.8 μL。

PCR反应程序包括：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火温度 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 7 min。

2.5 琼脂糖电泳，120 V 30 min，ExRed染色。

1.2.4基因测序：测序由擎科基因测序有限公司完成。测序结果经GeneMapper 4.0软件处理，读取每一份DNA在所有微卫星位点的片段长度。

1.3 统计方法

应用软件Popgen 1.32，计算该实验用猫群体的等位基因数，杂合度等参数。应用PIC CALC2.0软件计算该实验用猫群体的多态性信息含量(polymorphism information content, PIC)。

2 结果

2.1 虎皮猫基因组DNA提取结果

25只虎皮猫的全血样本DNA提取结果详见表1，图1和图2。

表1 25份全血样本DNA浓度

图1 1～12号动物基因组DNA琼脂糖电泳图

图2 13～25号基因组DNA琼脂糖电泳图

2.2 微卫星位点的PCR产物电泳结果

虎皮猫群体在74个备选微卫星位点的PCR结果中有37个有效扩增位点具有良好的多态性(等位基因数≥4)，其中FCA1062的PCR产物的电泳结果详见图3和图4。

图3 1～12号虎皮猫在FCA1062位点的PCR产物电泳结果图

图4 13-25号虎皮猫在FCA1062位点的PCR产物电泳结果图

2.3 STR扫描结果

STR扫描结果显示，37个微卫星位点的PCR产物的片段长度可以量化，与琼脂糖电泳的结果比较，可以定量分析实验用猫群体的遗传结构。FCA1062位点的基因测序结果详见图5和图6。

图5 FCA1062位点杂合基因型STR扫描结果

图6 FCA1062位点纯合基因型STR扫描结果

2.4 虎皮猫群体的遗传结构信息

将基因测序结果输入软件POPGEN1.32和PIC，统计分析得到25只虎皮猫群体在37个微卫星位点的遗传结构参数，该虎皮猫群体的平均杂合度为0.6021(0.3416-0.8088)，单因素方差分析观测杂合度与期望杂合度，P值>0.05，二者不存在显著性差异；平均多态性信息含量是0.552(0.3179-0.7874)；平均香农指数是1.1487(0.6800-1.9223)；平均有效等位基因数是2.6907(1.5188-5.2301)，单因素方差分析观测等位基因数与有效等位基因数，P值<0.01，二者存在显著性差异；37个位点中，32个位点的P值>0.05，处于哈代温伯格平衡(Hardy weinberg equilibrium，HWE)，5个位点的P值<0.01，偏离哈代温伯格平衡。具体数据详见表2.

表2 25只虎皮猫在37个微卫星位点上的遗传结构参数

3 讨论

本研究在前期工作的基础上[7]，应用37个微卫星位点分析华北制药厂虎皮猫群体的遗传结构，37个位点均表现出丰富的多态性(观测等位基因数Na≥4)，多态性表示群体内的遗传变异[8]，应用该37个多态性丰富的位点获取该群体的遗传结构信息。该群体的平均杂合度为0.6021(0.3416-0.8088)，介于0.5-0.7之间，符合封闭群群体的遗传结构标准，表明该群体已达到封闭群实验动物标准要求。群体的观测杂合度与期望杂合度不存在显著性差异，表明群体繁育方式合理，多样性丰富，能够为动物实验提供客观可信数据。PIC是检测群体多态性的标记值[1]。该群体的平均PIC是0.552(0.3179-0.7874)，PIC>0.5，表明该群体属于高度多态性群体。与人类群体的遗传结构特征相似，作为人类疾病的实验动物模型，能够较为客观地提供可比性数据。该群体的香农指数为1.1487(0.6800-1.9223)。香农指数反映了物种的丰富度和相对密度[9]。香农指数越大，表明等位基因分布越均匀。香农指数主要用来衡量遗传多样性以及遗传多样性的分布情况。有效等位基因数是反映生物群体遗传变异程度的一个指标,有效等位基因数与观测等位基因数越接近,说明等位基因在群体中的分布越均匀。通过微卫星技术检测等位基因数在不同染色体上的分布,从而获得等位基因的分布情况。该群体的平均有效等位基因数是2.6907(1.5188-5.2301)，观测等位基因数与有效等位基因数存在显著性差异，表明该群体等位基因分布不均匀。群体遗传学中，HWE是最重要的指标。HWE是指等位基因频率与基因型频率一致。偏离HWE的起因主要是选择和非随机交配。该群体在32个微卫星位点符合HWE，在5个位点偏离HWE。偏离HWE,表明出现近亲繁殖，种群分层，基因分型问题等[10]。实验动物繁育机构应采取必要措施保障群体遗传结构的稳定。

微卫星标记技术广泛应用于动物、植物、微生物和细胞的品种品系鉴定，尤其是在实验小鼠，大鼠，地鼠和小型猪的遗传质量控制方面有较为广泛和深入的应用[11]。2017年中国实验动物学会组织起草并发布实施了团体标准T/CALAS 21-2017小鼠、大鼠微卫星DNA标记检测方法[12]，标志着我国实验动物遗传质量控制手段已逐步实现与国际水平接轨。实验用猫的遗传质量控制标准即将发布实施，近交系实验动物要求个体之间具有基因一致性，封闭群实验动物要求群体内个体的遗传多样性丰富，而作为群体整体的遗传结构稳定。虎皮猫群体的遗传多样性分析的相关资料甚少，衣帅等[13]在2013年应用24个微卫星标记对实验用虎皮猫群体的34只动物进行过遗传结构分析，本研究保留与2013年研究的相同微卫星位点，比较同一群体，同一组微卫星位点2012年和2017年获取的遗传结构数据的差异，进行单因素方差分析，结果显示该虎皮猫群体的关键遗传多样性参数杂合度，香农指数，等位基因数均无显著性差异。表明该虎皮猫群体经过5年的繁育，遗传结构依然稳定。遗传漂变是实验动物饲养繁育过程中必然发生的过程，因此，定期开展遗传质量检测工作意义重大。遗传质量检测能够最小化遗传漂变对实验动物质量的影响，同时最大化动物实验结果的可重复性[14-15]。

综上所述，本研究结果表明微卫星标记技术是一种有效的封闭群实验动物群体遗传结构分析手段，本研究成果为我国实验用猫群体的遗传质量控制提供检测方法。实现了我国实验动物质量检测水平与国际水平接轨的目的，同时也为实验用猫群体的开发利用提供保证。