基于液氮研磨法的流式细胞术检测马铃薯倍性的研究

2021-01-22郑英转吕燕杨东旭李国威王洪洋李灿辉

生物技术通报 2021年1期

郑英转吕燕杨东旭李国威王洪洋李灿辉

（1. 云南师范大学云南省马铃薯生物学重点实验室，昆明 650500；2. 云南师范大学云南省高校马铃薯生物学重点实验室，昆明 650500；3. 云南师范大学生命科学学院，昆明 650500；4. 甘肃省礼县三峪乡九年制学校，陇南 742219）

流式细胞术（Flow cytometry，FC）是一种利用流式细胞仪（Flow cytometers）快速多参数分析流体中单个细胞（或其他任何微粒，如细胞核、微生物和染色体制剂等）的技术［1］。目前，流式细胞术广泛应用于免疫学、分子生物学、细菌学、病毒学等领域。在植物学研究中，流式细胞术主要用于检测植物细胞核DNA的含量以及染色体的倍性等方面［2-4］。根据细胞分裂的原理，在分裂过程中生物体中会同时存在含有2n和4n染色体数的细胞核，而染色体数目与DNA含量成正相关，所以测得细胞周期不同阶段的DNA含量，就可以间接反映出所测细胞的染色体倍性水平［5-6］。一般而言，用流式细胞仪检测得到的流式图谱中，其横轴都有2个峰，第一个峰表示含2n个染色体细胞核的荧光强度（即G0/G1期，M3峰），第二个峰表示加倍后的（即4n染色体）细胞核荧光强度（即G2/M期，M4峰）；其纵轴则表示检测到的细胞数目。用流式细胞仪检测DNA含量时首先必须要对DNA进行荧光染色，常用的核酸荧光染料有碘化丙啶（Propidium iodide，PI）、异硫氰基荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）等。

马铃薯（Solanum tuberosum）是全球解决粮食短缺和消除贫困的重要作物，分布较为广泛，且染色体倍性丰富。在自然界中有二倍体（2n= 24）、三倍体（2n= 36）、四倍体（2n=48）、五倍体（2n=60）、六倍体（2n= 72）存在。这些不同倍性马铃薯资源具有抗病、抗虫、耐极端环境等优良性状，是马铃薯育种工作中重要的种质资源［7］。染色体倍性鉴定是马铃薯倍性育种及应用研究的重要环节。如何应用最简便、有效且尽可能早期鉴定出植株的倍性水平，可以大大减少育种的工作量及盲目性，降低成本，加速育种进程，对马铃薯品种选育具有重要意义。

尽管马铃薯倍性鉴定方法有很多种［8］，但是利用流式细胞术法对其染色体倍性鉴定的应用研究仍然较少。本研究以流式细胞术为基础，使用刀片切碎法和液氮研磨法制备马铃薯细胞核悬液，比较了这两种样品制备方法在测定倍性中的异同之处，并分析液氮研磨法制备的细胞核悬液在不同时间梯度的核酸荧光染料染色下对测定结果的影响，在此基础上建立一套适用于马铃薯倍性鉴定的高效样品制备方法，旨为后续大规模马铃薯倍性鉴定和推动马铃薯育种工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

云南师范大学马铃薯课题组前期以四倍体栽培种C88（S. tuberosumssp.andigena）为母本、双单倍体诱导系二倍体IVP101（S. phurejia）为父本进行杂交，创建C88孤雌诱导后代群体。以20份C88孤雌诱导后代、C88及IVP101为样品制备材料，将其种植在温室中，待植株生长至2个月时，选取健康无病斑且大小适中的成熟叶片0.3-0.5 g（大约两片叶子）进行试验。

1.2 方法

1.2.1 裂解液的配制试验过程中所用裂解液的配方如下（以配制1 L为例）：氯化镁（MgCl2）9.148 g、柠檬酸钠（C6H5O7Na3·2H2O）8.822 g、3-吗啉丙磺酸（C7H15NO4S）4.186 g和Triton X-100（液体）1 mL。将以上试剂溶解于无菌双蒸水中，并于4℃保存，配制过程中一定要使Triton X-100充分溶解。

1.2.2 刀片切碎法细胞核悬液的制备（1）从温室取适当叶片，装入自封袋，编号（如果当天不能处理叶片，可放4℃保存过夜）。（2）取直径6 cm的小培养皿分别按照所取材料编号，把叶片用无菌双蒸水冲洗干净，用滤纸擦干水，放入相应编号的培养皿中，加入4℃预冷的裂解液2 mL，用刀片快速将叶片切碎（此步骤每个样品平均耗时大约7.5 min），然后放于冰上裂解至少30 min，使细胞核释放出来。（3）吸取培养皿中裂解液，用400目的滤膜将其过滤至1.5 mL的离心管中，过滤后的离心管放冰上，直到所有的样品过滤完。（4）于4℃离心机中1000-2000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀即是细胞核。（5）向沉淀中加入1 mL预冷的裂解液，加入荧光染料PI（1 mg/mL）50 μL，然后用震荡仪重新悬浮沉淀，于冰盒中或者4℃黑暗避光染色。

1.2.3 液氮研磨法细胞核悬浮液的制备（1）取材方法同1.2.2，从温室取的叶片用无菌双蒸水冲洗干净，用滤纸擦干水分。（2）将清洗干净的叶片放入研钵中，加入适量（5-10 mL）液氮迅速研磨成粉末（此步每个样品平均耗时大约1.5 min），然后加入2 mL预冷的裂解液，再将其转入5 mL离心管中插入冰上裂解30 min。（3）用400目滤膜将其过滤至1.5 mL离心管中，待所有样品都过滤完后，于4℃离心机中1000-2000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀即是细胞核。（4）向沉淀中加入1 mL预冷的裂解液，加入荧光染料PI（1 mg/mL）50 μL，然后用震荡仪重新悬浮沉淀，于冰盒中或者4℃黑暗避光染色。

1.2.4 荧光染料染色时间的设置为了验证刀片切碎法和液氮研磨法制备的细胞核悬液之间测定结果有无差异时，荧光染料染色时间设置为30 min；为了验证液氮研磨法制备的细胞核悬液在不同染色时间梯度下的测定结果是否有差异时，设置的染色时间为15 min、30 min、60 min、6 h和12 h。

1.2.5 流式细胞术测定与数据分析取20份C88孤雌诱导后代植株叶片，然后将从每一株植株上获取的叶片平均分为2份，一份利用液氮研磨法制备细胞核悬液；另一份用刀片切碎法制备细胞核悬液，然后进行染色（用PI染料染30 min）和上机测定。所用流式细胞仪品牌为ACEA NovoCyte，测定步骤按照仪器操作说明进行，数据处理软件为NovoExpress 1.3.0。最终得到的流式峰值图中，横坐标为细胞核DNA相对含量的荧光强度，纵坐标为细胞核数量；流式散点图中，横坐标为细胞的总荧光强度，纵坐标为颗粒度。数据的统计分析用SPSS 20.0软件完成，P＜0.05时认为存在统计学意义上的显著性差异。

2 结果

2.1 不同方法制备细胞核悬液的效果比较

图1 不同制备方法获得的细胞核悬液中细胞核所占的比例

2.1.1 细胞核悬液中细胞核的比例对20份C88孤雌诱导后代植株叶片分别进行液氮研磨法和刀片切碎法制备样品，经流式细胞仪检测，发现均可产生非常明显的散点图（图1-A和图1-B）。它们都在横坐标为105.6和105.8处即分别展示出细胞核显著聚集在一起的现象，并且具有不同荧光强度的2个细胞核群可以完全分开，说明这两种制备方法都能收集到的完整细胞核。但是，利用液氮研磨法制备的样品中，除了明显被荧光染料染色的细胞核之外，还伴随大量其他颗粒成分存在，导致图中显示的细胞核聚集程度不是十分紧密（图1-A），而在刀片切碎法的结果中，其他颗粒成分则较少，细胞核聚集程度较为紧密（图1-B）。此外，液氮研磨法制备的细胞核悬液中，细胞核的占比约为34.73%，而在刀片切碎法制备的悬液中，细胞核的占比约为61.63%（图1-C）。以上结果说明，虽然液氮研磨法得到细胞核的数量比刀片切碎法得到的少，但这两种方法制备的细胞核悬液并不会导致细胞核的染色结果有差异。

2.1.2 荧光强度的比较将上述2种样品制备方法得到的细胞核悬液经过流式细胞仪检测后，发现无论是液氮研磨还是刀片切碎，其结果都能得到明显的峰图（图2）。其中，第一个峰为含2n个染色体细胞核的荧光强度，也就是表示处于G0/G1期的细胞核DNA含量（图中标为M3），第二个峰为含4n个染色体细胞核荧光强度，即表示处于G2/M期的细胞核DNA含量（图中标为M4）。从图2-A和图2-B可以直观地看出，在横坐标上，液氮研磨产生的M3、M4峰和刀片切碎产生的M3、M4峰基本位于坐标轴相同的位置。同时，将用这两种不同方法得到的M3和M4峰值数据进行了统计分析，结果发现不同方法得到的M3和M4的数值之间并无统计学上的差异性（图2-C和图2-D）。另外，用M4的数据除以M3的数据得到的比值在液氮研磨和刀片切碎中各自均接近2，并且互相之间也无统计学上的差异（图2-E），这也符合细胞分裂时DNA含量变化的基本规律。结果表明，在利用流式细胞仪测定马铃薯倍性时，液氮研磨法制备细胞核悬液和刀片切碎法制备细胞核悬液所得的结果是一致的，这两种方法都是可行的。

图2 不同制备方法获得的细胞核悬液中细胞核DNA含量的直方图

2.2 液氮研磨法中不同染色时间的效果比较

在细胞核悬液的荧光染料染色时间方面，前人的报道［9］和文中所用均为30 min，当这一时间缩短或者延长时是否会对倍性鉴定结果造成影响呢？我们就这一问题继续开展了探究。以20株C88孤雌诱导后代植株为研究材料，用液氮研磨法制备细胞核悬液，然后进行PI染料染色，但在染色时间上，设置15 min、30 min、60 min、6 h和12 h等不同的时间梯度，每一时间点染色结束后立即进行流式细胞仪检测，最终将所有结果汇总分析。结果发现，5个染色时间梯度的M3和M4峰在纵坐标轴上的各自位置基本是一致的（图3-A-E），并且在不同时间梯度上M3和M4峰值之间也没有显著差异（图3-F）。结果说明，使用液氮研磨法制备的细胞核悬液按上述任一时间点进行染色时其倍性鉴定结果是一致的。

2.3 利用已知倍性马铃薯材料检验液氮研磨法的可靠性

为了进一步确定液氮研磨法制备的细胞核悬液在测定马铃薯倍性应用中的可靠性，选取已知四倍体马铃薯C88和二倍体马铃薯IVP101为材料，试验过程中设置染色时间为30 min。在得到的直方图中（图4），四倍体马铃薯C88的M3峰的荧光强度为（572812±23210）（n=15），M4峰的荧光强度为（1108477±45678）（n=15）；二倍体马铃薯IVP101的M3峰的荧光强度为（300356±32502）（n=10），M4峰的荧光强度为（576561±58139（n=10）。四倍体马铃薯C88的M3和M4峰的荧光强度分别是二倍体马铃薯IVP101的M3和M4峰荧光强度的1.9倍和1.9倍，均接近2倍，符合4倍体和2倍体理论比值。该结果进一步证实了基于液氮研磨法的流式细胞术测定马铃薯染色体倍性的可靠性。

图3 液氮研磨法中不同染色时间对马铃薯倍性测定结果的影响

3 讨论

相对于其他鉴定染色体倍性的方法而言，流式细胞仪能够快速地进行物种染色体倍性检测，并且鉴定的结果真实可靠，已经广泛应用在动植物染色体倍性鉴定方面。在利用流式细胞术鉴定染色体倍性的试验中，如何快速获取足够完整的细胞核是关键。目前，在植物倍性检测时大多用刀片切碎法来制备细胞核悬液，如葡萄［10］、香蕉［11］、荔枝［12］、西瓜［13］、梨［14］、猕猴桃［15］、蒙古冰草［16］和槭树［17］等。虽说该方法能够得到较高完整样品细胞核，但是同时也存在费时、费工等缺陷，不适于大批量样品进行流式细胞术分析。本研究中，选取马铃薯C88孤雌诱导后代群体中的20个植株做重复试验，在制备马铃薯叶片细胞核悬液时首次使用了液氮研磨法，并将这种方法和刀片切碎法进行了比较。结果发现液氮研磨叶片简便快速，磨碎单个样品的平均耗时约为1.5 min，相比之下，刀片切碎单个样品的平均耗时约为7.5 min。同时对液氮研磨法制备的细胞核悬液的纯度和细胞核所占比例进行了分析，发现该法制备的细胞核悬液中杂质稍多于刀片切碎法，但是在荧光染料染色30 min的情况下，具有不同荧光强度的2个细胞核群可以完全分开。另外，将液氮研磨法和刀片切碎法得到的直方图进行了比较，结果也显示用刀片切碎法得到的直方图峰型细直、2个峰之间的黏连体少，而液氮研磨法得到的峰型总体基部偏大、2个峰之间黏连体偏多，但是通过对比测得的荧光强度（即DNA的含量）以及其比值发现，这两种方法之间并没有显著的差异，说明液氮研磨法并不会影响倍性的检测结果。

前人报道马铃薯倍性检测时使用的荧光染料染色时间只有30 min一个时间点［9］，为了探索不同染色时间阶段对马铃薯倍性检测的影响，在应用液氮研磨法制备样品的基础上设置不同的染色时间梯度，发现15 min、30 min、60 min、6 h和12 h等不同的时间梯度下，倍性测定结果之间并无统计学上的显著差异，说明这些时间点均可用于测定倍性过程中的染色步骤。另外，应用液氮研磨法对已知倍性的四倍体马铃薯C88和二倍体马铃薯IVP101进行鉴定，结果符合预期，进一步说明基于液氮研磨法的流式细胞术可用于马铃薯倍性分析。