RNA干扰技术在昆虫学领域研究进展

徐雪亮 王奋山 刘子荣 范琳娟 季香云 蒋杰贤 姚英娟

（1. 江西省农业科学院农业应用微生物研究所，南昌 330200；2. 上海市农业科学院生态环境保护研究所，上海 201403）

1 RNAi沉默基因机制

RNAi是由外源双链RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）介导引起的目的基因mRNA沉默的现象［1］。自Fire等［2］1998年首次报道了注射外源dsRNA可造成秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）内源性mRNA沉默的现象以来，RNAi已迅速成为研究基因功能、调控和有机体层面的反向遗传学技术手段。随着RNAi技术的快速发展与应用，其在病虫害防治管理方面也显示出了巨大的潜力，并在双翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目、直翅目及鳞翅目等许多昆虫中已经得到了成功应用［3］。

目前已知动物中存在3种不同类型的小RNA可以触发相应的RNAi通路。第一种是由短/小干扰RNA（Short/small interfering RNA，siRNA）调控的siRNA通路，siRNA由外源或内源的dsRNA加工为长度一般为19-21 bp的dsRNA；第二种是由微小RNA（MicroRNA，miRNA）调控的miRNA通路，miRNA是长度21-24 bp的单链非编码RNA；第三种是与PIWI（P-element induced wimpy testis）蛋白相互作用的小RNA（piRNA）调控的piRNA通路，piRNA是长度23-36 bp的单链RNA［4］。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的dsRNA时，该mRNA发生断裂而导致基因表达沉默。当dsRNA（外源或自身产生）进入细胞后，首先由RNaseIII核酸酶家族的Dicer与dsRNA结合，随后dsRNA被降解成19-21 bp长度的小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA），然后siRNA与RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，再解旋成单链RNA，并由该复合体主导RNAi效应［5］。RISC被活化后，受siRNA引导（Guide-strand），通过碱基互补配对特异性地结合在同源mRNA（靶标）上，切断标靶mRNA，引发靶标mRNA的分解，从而引发目标基因的表达沉默。

2 双链RNA的转运机制

一般来说，dsRNA进入生物体内后才能诱导RNA干扰反应。目前有两种潜在的机制：秀丽隐杆线虫体内跨膜通道介导的途径和果蝇S2细胞通过吞噬作用的途径。昆虫对dsRNA的摄取是高度复杂的，这不仅是因为不同物种可能有不同的机制，还因为同一物种可能依赖于多种机制。在昆虫研究中，最基本的将dsRNA导入昆虫体内的方法主要包括显微注射法、饲喂法、浸泡法和转染法。近些年来，各种各样的技术被开发并纳入这些基本的方法中，包括阳离子脂质体辅助、纳米颗粒激活、共生体介导和植物介导的传递［6］。

2.1 显微注射法

显微注射法是应用最普遍的传递dsRNA的方法［7］，将少量的dsRNA加入适当的溶液中直接注射到昆虫胚胎或体内［8-9］。1998年，Kennerdell和Carthew［10］用显微注射的方法将果蝇翅形成基因frizzled和frizzled2的dsRNA注入胚胎中，分别得到这两个基因的缺陷型，首次实现了显微注射dsRNA来研究昆虫基因的功能。

2.2 饲喂法

饲喂法是与实际生产实践相结合的一种重要方法，在昆虫的食物或者人工饲料中加入靶标基因的dsRNA，dsRNA随着昆虫取食进入体内而达到导入dsRNA的目的。dsRNA的喂食主要方式：一是在微生物中表达dsRNA，供昆虫取食，成功应用微生物的有大肠杆菌［11］和酿酒酵母［12］；二是在体外合成dsRNA，再把dsRNA混在食物或溶液直接给昆虫食用。

2.3 浸泡法

浸泡法是指将溶有dsRNA的液体浸泡或者喷洒于昆虫的体表或者受精卵，从而达到靶标基因沉默的一种方法。第一例浸泡法的实验是在线虫中实现的，直接将线虫浸泡在含有dsRNA的溶液中，成功实现了RNA干扰［13］。在昆虫中，使用这种方法主要在细胞株中实施［14］。

2.4 转染法

转染法通过转染剂将dsRNA直接传送到细胞内，比之浸泡法，转染法可以更有效地将dsRNA转运到细胞中［15］。Whard等［16］在果蝇幼虫上测试了TransFectin、DMRIE-C、Cellfectin和Lipofectamine 2000等几种转染试剂，转染法导致靶标基因表达下调了31%-52%，而浸泡法仅下调了5%-8%，说明转染法有利于虫体对dsRNA的吸收，更有效地实现RNAi效果。

2.5 转基因植物法

转基因植物法是指通过转基因技术让植物自身表达靶标基因的dsRNA，昆虫取食植物的同时摄入dsRNA，可以沉默昆虫体内特定靶标基因的表达，导致其生长发育异常甚至死亡从而达到防控害虫的作用［17］。

3 RNAi技术在不同目昆虫中的应用

3.1 RNAi技术在双翅目昆虫中的研究进展

双翅目腹黑果蝇是昆虫领域被普遍用于科学研究的最主要的一种模式昆虫。合成宽带果实蝇Zeugodacus scutellata一个雌成虫高度表达的性别决定基因Transformer-2（Zs-Tra2）的dsRNA，通过向幼虫显微注射或者饲喂可表达该dsRNA的大肠杆菌细胞，可显著增加雄虫的比例［18］。Zeng等［19］研究报道了利用显微注射仪将蚊子气味受体基因dsRNA注入致倦库蚊雌蛹，然后通过排斥性生物活性测定试验筛选出了介导驱避对于特异植物源化合物的气味受体。通过饲喂dsRNA沉默迟眼蕈蚊一个A型谷胱甘肽S转移酶基因BoGSTd2的表达水平，降低了毒死蜱和噻虫胺诱导的活性氧的清除能力，从而增强了迟眼蕈蚊对毒死蜱和噻虫胺的敏感性。说明BoGSTd2基因在毒死蜱和噻虫胺解毒中起重要作用，保护迟眼蕈蚊组织不受这些杀虫剂诱导的氧化应激的影响［20］。白纹伊蚊卵黄蛋白基因Vitellogenin-2（Vg-2）的高表达水平与糖喂养的雌蚊最低的求偶活动相关。通过RNA干扰敲除Vg-2基因恢复了雌蚊的求偶行为，证明白纹伊蚊Vg-2基因表达在调节求偶行为中起着关键作用［21］。

3.2 RNAi技术在鞘翅目昆虫中的研究进展

科罗拉多马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）（Say）是一种主要的茄科作物害虫，MDR基因是一类编码ABC跨膜转运蛋白B亚家族（ABCB转运蛋白）的多药抗性基因。Favell等［22］将可表达多药抗性MDR基因dsRNA的细菌涂抹马铃薯叶片饲喂幼虫，MDR基因的表达量相对于对照显著降低了90%以上，生物活性测定试验结果显示成虫的存活率与对照相比无显著差异，说明马铃薯甲虫的MDR转运蛋白与伊维菌素的解毒作用无关。茄二十八星瓢虫是蔬菜上危害最严重的害虫之一。让瓢虫幼虫和成虫取食涂抹表达dsHvSnf7细菌的龙葵叶片，可导致1龄幼虫、2龄幼虫和成虫的死亡率分别是98%、88%和60%，说明HvSnf7可以作为一种潜在的RNAi的靶标基因用于防控茄二十八星瓢虫［23］。胰岛素/胰岛素样生长因子（Insulin/insulin-like growth factor，IGF）信 号（Insulin/insulin-like growth factor signaling，IIS）是昆虫在营养依赖条件下的性选择武器生长的潜在的一种主要生理机制。然而，营养状态与武器生长相结合的分子机制仍是未知的。Okada等［24］注射胰岛素肽类基因GcorILP2的dsRNA可减小广角面粉甲虫Gnatocerus cornutus雄虫下颌骨的大小，说明GcorILP2基因参与调控广角面粉甲虫武器的生长。Pinheiro等［25］通过显微注射法和饲喂法转运4个靶标基因（Prosα2、RPS13、Snf7和V-ATPase A）的dsRNA进入斯里兰卡象鼻虫成虫体内发现，两种转运方式均能触发稳定的RNAi反应，这表明基于RNAi技术可以开发一种可选择性的相对环境安全的控制这种害虫的策略。

3.3 RNAi技术在膜翅目昆虫中的研究进展

经过改造蜜蜂肠道一种共生菌Snodgrassella alvi wkB2，使其可以持续产生dsRNA，调控宿主基因表达，保护蜜蜂免受病原体和寄生虫侵害［26］。黄疯蚁（Nylanderia fulva）是美国一种新的入侵害虫，以高繁殖和形成超级群体的能力对当地生态环境为害严重。科研工作者将可表达NfCOPβ（参与蛋白质转运基因）和NfArgK（细胞能量储备调节基因）dsRNA的细菌加入人工饲料供工蚁取食，导致蚂蚁的存活率相对于对照显著降低了15%［27］。蝶蛹金小蜂淀粉酶基因PpAmy1在其消化道高度表达，利用RNAi技术沉默该基因可显著地缩短成虫寿命［28］。在蜜蜂中，双链RNA（dsRNA）和小干扰RNA（siRNA）均能显著减少靶向基因的表达水平，研究表明siRNA混合对酪胺受体tyr1基因沉默效率优于dsRNA，并且dsRNA与siRNA的敲除时间长短不同［29］。将合成的叶蜂Ardsx基因dsRNA注射入幼虫腹部，通过形态学观察发现雄蜂生殖器官产生了严重缺陷［30］。

3.4 RNAi技术在半翅目昆虫中的研究进展

新热带棕色椿象Euschistus heros是南美洲大豆生产中一种最主要的害虫，其转录组测序分析鉴定RNA干扰的核心基因发现缺乏sid-like基因，并通过注射dsRNA并进行实时荧光定量PCR检测siRNA机制的有效性。最后设计靶向V-ATPase-A基因的dsRNA，显微注射96 h后成虫的死亡率为35%，说明尽管缺乏sid-like基因，显微注射dsRNA仍然具有RNAi效果［31］。向棉粉蚧成虫和蛹注射DNA甲基转移酶基因PsDnmt1A和PsDnmt1B的小干扰RNA，24 h和72 h后这两个基因的表达水平均显著下降，导致雌成虫死亡和体色异常，还造成雄成虫翅发育异常。结果表明，DNA甲基转移酶基因在调节棉粉蚧雌雄异形方面起着关键作用［32］。Chen等［33］将合成的两个味觉受体基因NlGr10a和NlGr10b的dsRNA，注射入羽化1 d的褐飞虱雌成虫体内，结果发现dsNlGr10a不会影响NlGr10b的表达量。NlGr10a和NlGr10b被敲除后，褐飞虱产卵数量和孵化率分别下降了43.19%和26.14%，37.82%和10.70%。此外，NlGr10a基因敲除后的卵孵化率明显低于NlGr10b基因敲除后的卵孵化率，说明NlGr10a和NlGr10b调节了褐飞虱的繁殖力，NlGr10a对褐飞虱繁殖力的影响强于NlGr10b。3种蚜虫——橘蚜（Aphis citricidus）、豌豆长管蚜（Acyrthosiphon pisum）和桃蚜（Myzus persicae）的一个表皮蛋白基因CP19s序列相似度为86.6%-94.4%，但与其捕食性天敌龟纹瓢虫的序列相似度很低。因此，设计合成CP19s基因dsRNA，用于饲喂3种蚜虫，然后将蚜虫幼虫供于龟纹瓢虫取食，结果发现3种蚜虫CP19s基因的表达水平下降了39.3%-64.2%，导致蚜虫的死亡率为45.8%-55.8%。同时，该基因的dsRNA对龟纹瓢虫CP19s基因的表达水平和发育历期均无显著影响。结果说明这个表皮蛋白基因CP19是一个有前途的针对蚜虫的RNAi靶点，可以通过dsRNA设计来控制蚜虫同时对捕食性天敌无显著不利影响，是一种有效的RNAi害虫防治策略［34］。

3.5 RNAi技术在直翅目昆虫中的研究进展

东亚飞蝗作为一种模式昆虫，也是直翅目昆虫中被研究最多的一种昆虫。DNA甲基化在动物的行为可塑性中起着重要的作用。通过RNAi降低东亚飞蝗DNA甲基转移酶基因Dnmt3的表达量，显著改变了蝗虫大脑基因表达谱，并抑制了激素受体HR3的表达，导致独居蝗虫的与群居和拥挤相关的移动能力显著降低［35］。通过显微注射东亚飞蝗的芳烃受体基因LmAhR的dsRNA，有效降低了色氨酸诱导的AhR基因的和细胞活性氧产物的表达水平，从而减弱了色氨酸对蝗虫的致死作用［36］。在诱导滞育（短光周期）处理下，东亚飞蝗的一种神经肽FaRPs的前体基因flrf表达水平明显高于非诱导滞育（长光周期）处理。向东亚飞蝗注射dsflrf，使其表达量降低了75.8%-89.2%，导致蝗虫滞育率显著下降，说明flrf基因可促进蝗虫的滞育［37］。

3.6 RNAi技术在鳞翅目昆虫中的研究进展

Gurusamy等［38］利用Cellfectin II转染试剂构建的dsRNA，将其用于饲喂草地贪夜蛾幼虫，检测到iap基因显著下调，导致幼虫生长迟缓，甚至死亡，说明使用该转染剂传递dsRNA可以提高草地贪夜蛾细胞和组织的RNAi效率。Br-C基因是昆虫20-羟基蜕皮激素信号通路中一种重要基因，在昆虫的生长过程中起着至关重要的作用。舞毒蛾4龄幼虫取食表达LdBr-C基因dsRNA细菌的人工饲料，敲除导致幼虫发育畸形，体重显著下降，取食6 d后的死亡率为67.18%。同时Br-C基因的敲除还显著下调了8个与几丁质合成和代谢有关的关键基因的转录水平，这些结果表明Br-C基因的敲除影响舞毒蛾幼虫的发育和几丁质的合成［39］。向小菜蛾敏感种群幼虫注射PxTryp_SPc1基因的dsRNA，显著下调PxTryp_SPc1基因的表达量，降低显著降低了酪蛋白水解和胰蛋白酶活性，使Cry1Ac原蛋白激活，从而降低了小菜蛾敏感种群对Cry1Ac原蛋白的敏感性，这说明该基因的低水平表达促进了木小菜蛾对Cry1Ac的抗性［40］。家蚕Bmsage是一种bHLH转录因子，参与家蚕胚期丝腺的发育。Hou等［41］合成家蚕Bmsage的dsRNA并注射入卵内沉默该基因的表达，导致丝腺的细胞数量减少，影响蚕丝的合成和产量，证明了Bmsage通过细胞周期蛋白通路调控家蚕丝腺的发育。

4 总结与展望

RNAi是现阶段研究昆虫功能基因组领域普遍应用的一种技术，尤其在昆虫靶标基因功能方面表现出高效可靠的潜能［42］。但是，RNAi技术的应用也存在着一些问题，最主要的是多种因素的影响会降低干扰效率，导致干扰效果并不理想。首先是靶标基因的选择，昆虫不同基因的干扰效果并不相同。其次，不同昆虫种类间RNAi的效果也有差异，如鞘翅目昆虫的RNAi效果很好，而鳞翅目昆虫的RNAi效果均不太理想［43］。再次，昆虫体内的核酸酶可以降解dsRNA，这是对豌豆蚜进行RNAi所需要解决的一大难题［44］。此外，昆虫不同部位组织的RNA干扰效率也不一致［45］。RNAi在病虫害管理中的广泛应用面临主要问题包括：昆虫间RNAi效率不稳定、缺乏可靠的dsRNA传递方法、脱靶和非靶标效应以及昆虫种群中潜在的抗性发展等。

尽管RNAi效率受到多种因素的影响，但是该技术已成为一种被广泛应用于研究昆虫生长发育、生理和分子过程的强有力的工具，其对环境友好、安全及对非靶标昆虫影响小的特点，具有成为害虫绿色防治新策略的巨大潜力。未来，RNAi技术仍将是研究靶标基因功能的首选科研手段，随着科学技术的不断发展和创新，更高效率和更加快速的RNAi技术在昆虫科学研究中尤其是在开发dsRNA杀虫剂防治害虫中有广阔发展前景。