密闭环境中空气微生物检测和监测技术分析

2021-01-22许丽红

生物化工 2021年1期

许丽红

（1.广东省科学院微生物研究所广东省微生物分析检测中心，广东广州 510070；2.华南应用微生物国家重点实验室，广东广州 510070）

密闭环境状态下，人们的活动以及工作过程中机械、电子设备的操作施工会导致出现高温、高湿的情况，普遍温度达到45 ℃以上，湿度接近饱和。这种环境能够提高微生物的繁殖速度，尤其是部分病毒微生物。长时间不进行空气流通，会使密闭环境中充满受污染的空气。长时间处在这种空气环境下会对人体造成一定伤害。

1 密闭环境中空气微生物的主要来源

现阶段，关于密闭环境中空气微生物种类的相关研究较多，但缺乏对于微生物来源的研究[1]。自然环境中的空气微生物主要有细菌及真菌，分布浓度主要与环境清洁频率、建筑物植被密度等相关。而密闭环境中的细菌浓度又与自然环境中的细菌浓度呈正相关[2]。另一方面，人为因素是密闭环境中空气微生物的主要来源。人类在进出密闭环境时，自身服装、所携带的作业设备以及器具等都会附着一些直径小于100 μm的悬浮颗粒物，其中大于10 μm的颗粒物会降落在地面上，而小于10 μm的颗粒物会飘浮在空中，这些悬浮物会携带一定的空气微生物。且在密闭环境中，人体本身就是一个污染源，其新陈代谢所产生的皮屑、口腔分泌物、毛发等大多带有致病微生物，夹杂在空气中形成空气微生物。人类患病咳嗽时会产生75 000个左右的颗粒物，其康复后咳嗽时的颗粒物为50 000个左右，这些颗粒物也是空气微生物的来源之一。其他人体活动也会成为空气微生物的二次来源，如人体排泄时，排泄物中一半以上的固体都夹杂着细菌，在进行冲厕时，这些细菌会雾化漂浮在空气中，每次大约会产生15万个气溶胶颗粒，绝大多数的颗粒小于5 μm，并能够在密闭环境中持续停留。

2 密闭环境空气微生物检测和监测技术探讨

2.1 生物芯片技术

生物芯片技术是在微电子加工技术的支持下，在微生物表面构建微生物分析系统，针对蛋白质、细胞等进行准确、高通量化研究，从而达到检测密闭环境中空气微生物的目的。生物芯片中汇集着大量的分子原件，能够在一定时间内进行多方位生物分子检测，其检测效率远超于传统检测技术，被科学家称为20世纪继大规模集成电路之后的又一次技术改革。生物芯片的应用在基因组学、蛋白质组学方面都有着极高的研究价值，实现了空气微生物检测和监测工作的多参数同步测定，完全符合密闭环境的特殊场景要求。此外，生物芯片技术还具备多种空气微生物同时监测的功能，可以分析微生物的存在状态，据此采取相应的灭菌手段，从而控制密闭环境中的空气微生物数量。例如，SPR芯片检测技术是利用化学还原法将样本玻璃片制备成纳米金单膜层，其对设备的要求较低，且能够批量进行样本制备，有效控制检测成本。实际工作中，设计合成特异的bis-PNA探针，并借助硫醇化合物表面单分子自组装技术使探针牢固，可以提高SPR生物芯片的敏感性和空气微生物检测效果。同传感器单一检测方法相比，这种新型生物芯片检测系统更具备实用性，且造价低廉，可在密闭环境中空气微生物检测和监测工作中发挥极大的作用[3]。

2.2 生物衍生技术

生物衍生技术是一种新型空气微生物检测技术，主要应用于环境监测、工业生产等方面，其主要优点在于检测工序简单、检测时间短、不会对样本造成二次污染等。特别是对于密闭环境中的空气微生物进行活细胞检测，能够实现整个细胞系统的外源物质回应，从而满足微生物种类及密度的高效化测定。将测定结果同标准密度进行比对可以判断是否需要进行消毒作业。从原理来说，生物衍生技术的核心在于分析生物器件，通过对生物及生物衍生出来的敏感元件进行转化，得到与微生物相关的数字化电子信号，根据信号强度对样本进行判断。目前，生物衍生技术应用实验中常见的敏感元件主要由生物自身成分构成，其与样本环境中的微生物浓度有很大关系。与传统空气微生物检测技术手段相比，生物衍生技术的催化剂为固定化生物物质，虽然反应试剂的造价高昂，但可以多次重复使用，且自身工序简单、检测时间较短，能够及时得到检测结果。但其自身也存在着空气微生物检测种类及数量限制、检测功能较为单一、不能实现密闭环境的长期监测[4]等缺陷。

2.3 落菌检测技术

落菌检测技术也被称为自然沉降法，主要是将适合空气微生物生长的营养琼脂培养基经过消毒灭菌环节后，倒入无菌平皿中制作成落菌平板，放置于待测环境中。密闭环境中的空气微生物会在重力作用下自然沉降在落菌平板上，通过对平板内的微生物菌群进行分析，实现检测及监测的目的。实际操作中，空气中的微生物可以在培养基上形成单一的微生物菌落，根据菌落的数量可以计算微生物数量。

落菌平板的观察方法较多，如显微镜法、基质辅助激光解吸电离法（MALDI）、激光诱导荧光法（LIF）等。显微镜法是最基本也是应用最普遍的落菌平板观察方法，其借助显微镜对平板中的菌落及有机物质进行观察，常用于液体样本中的微生物观察任务；MALDI是一种现代化软电离技术，但受到信号强度的影响，只能对超过600 Da的微生物进行观察，其主要是用来完成大分子颗粒的观察任务；LIF是在一定角度下对落菌平板荧光辐射的二维或三维图像进行分析，有选择性地获得微生物分子结构检测结果，主要用于空气微生物中的细菌检测。

落菌检测技术的优点在于造价低廉、操作方法较为容易、不需要工作人员一直守在待测环境中以及对于空气微生物的损伤较小。但在收集过程中容易受到密闭环境的气流、粒子大小、人体活动等情况的影响，其检测结果存在一定的巧合性，不具备强有力的说服力。

2.4 撞击检测技术

撞击检测技术是当下较为普遍的民用密闭环境中空气微生物检测及监测技术。该技术基于空气微生物检测仪，在抽气动力的作用下，使存在于空气中的带菌粒子在较为狭窄的缝隙中高速流动，并与介质表面进行接触，于惯性作用下完成空气微生物取样。其中，直径较小的空气微生物粒子会直接通过采样器，而直径较大的空气微生物粒子会被收集起来。就目前发展技术水平而言，撞击检测技术采样后的器皿温度通常保持在37 ℃，并在48 h内完成带菌粒子检测。撞击检测技术的采样成本较低、操作简单且培养基处理方便，能够实现不同直径带菌粒子的分级采样。但就密闭环境而言，其不能够直接对空气微生物的数量进行检测，无法满足全方位监测密闭环境中空气微生物的要求。

2.5 液体检测技术

液体检测技术主要是针对密闭环境中的浮游微生物进行检测，尤其是浮游细菌。取密闭环境中部分待测空气注入无菌液体培养基中，采用菌液涂抹或倒平板的方法使其均匀分布，便于其在培养基上生长；经过一段时间的繁殖后，进行计数、分离、鉴定等工序。就原理而言，液体检测技术与撞击检测技术有一定的相似性，区别在于液体撞击技术是将空气微生物收集到液态化的培养皿中。当待测空气通过狭窄的通道管冲击到液体培养皿上时，所有悬浮颗粒物都会被液体培养基收集起来，并放置于适宜的培养条件下进行微生物检测。该过程会受到空气冲击风速的显著影响。若冲击风速为5 m/s，则收集效率在10%左右；而在静止状态下，收集效率则接近100%。液体检测技术中，大多数液体冲击采样器都是由玻璃制成的，相较于安德森采样器等金属采样器存在着造价较低的优势，且液体培养基基质对于空气微生物的损害程度较低。

2.6 酶抑制检测技术

酶抑制检测技术主要是通过商品化微量生化鉴定试剂盒来检测密闭环境中的微生物残留量，将样本与反应试剂放入仪器中进行检测反应，检测仪会计算出密闭环境空气样本中的具体微生物数值。一般来说，若致病微生物检验结果低于10%，说明密闭环境中微生物含量符合标准，反之则说明环境中存在致病微生物残留问题，需要进行灭毒杀菌处理。酶抑制检测技术操作便捷，对检测设备要求不高，简单培训即可进行检测，且灵敏度高，检测结果较有说服力，常用于细菌及真菌类微生物的检测。但是，酶抑制检测技术仅限于检测某些特定微生物，其原理是通过酶的功能基因易于受到某种微生物的影响，从而在一定程度上降低酶自身的活性强度，导致其失去原有生理作用，进而达到检测密闭环境中空气微生物的效果。将酶抑制剂放置于空气样品环境中进行反应，根据酶抑制剂活性受到抑制的情况，分析密闭环境空气样本中所含微生物含量。酶抑制检测是目前相对较为成熟的、应用较为广泛的一种密闭环境空气微生物检测和监测方法，其实验力度强、实验结果具备说服力，但检测环节使用的酶造价较为昂贵。若使用造价低廉的反应酶，其检测结果还需要进一步验证[5]。