表达2.3.2.1d 分支H5 亚型禽流感病毒HA 基因重组鸭瘟病毒的构建和评价

王 波，赵玉博，胡玉珍，丁蕾蕾，陈普成，焦晨晨，姜永萍，陈化兰，柳金雄

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江 哈尔滨 150069）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是负链RNA 病毒，属正粘病毒科，流感病毒属。1996 年,我国首次分离到H5N1 亚型高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HPAI）病毒（HPAIV），2003年以来，HPAI 相继在全球63 个国家发生，数亿只家禽和野生鸟类因其死亡[1-2]。根据世界卫生组织（WHO）数据，2003 年～2019 年，全球H5N1 流感感染人860 例，死亡454 例，致死率超过50%。每年全球约29 万～65 万人因流感死亡[3]。数年来的数据显示，流感仍是当前家禽养殖业和公共卫生安全的主要威胁之一。

水禽是流感病毒的自然宿主，不同亚型流感病毒均能从水禽中分离获得[4]。水禽感染大部分AIV后表现出不发病但向外界排毒的隐性症状[5]，这不仅为病毒在其体内变异和重配提供了条件，而且还能将病毒传播至易感的人和动物。因此，阻断流感病毒在鸭体内的传播是防控流感的关键。鸭瘟（Duck enteritis，DE）、鸭肝炎、禽流感是危害养鸭业最重要的病毒病，我国每年养鸭量约40 亿只，占世界总养殖量70%左右[6]，然而对于鸭上述3 种重要病毒病疫苗的研究却相较其它家禽滞后。目前，DE和鸭肝炎的预防主要使用减毒活疫苗，而鸭AI 的预防与鸡相同，均为灭活苗[7]。但由于鸭感染大多数AIV 呈隐性症状，所以养殖户对鸭的免疫缺乏经济驱动力，导致鸭AIV 疫苗免疫覆盖率较低。本研究构建了表达H5 亚型AIV 血凝素（Hemagglutinin，HA）基因的重组鸭瘟病毒，其可作为防控水禽鸭瘟和水禽流感的二联活疫苗候选株，为提高鸭H5 亚型AIV 疫苗免疫覆盖率提供了新方案，为水禽流感的防控提供了新思路，具有重要的公共卫生意义。

本研究以前期构建的DEV 疫苗株多片段拯救系统平台[7-8]，构建了表达近年来我国H5 亚型AIV 优势流行抗原分支（Clade 2.3.2.1d）代表病毒CK/LN/SD007株HA基因的重组病毒，命名为rDEV H5-12，并对其生物学特性、免疫原性及免疫效力进行了系统评价，为水禽流感的防控提供了数据参考。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料DEV 疫苗株拯救系统5 粘粒（即pFosT、pFosH、pFosJ、pFosQ、pFosD）、pFosTus78-ccdB K+、pBD-LN/SD007HA 和重组质粒pEN⁃TR-SV40 由本实验室构建保存；Clade 2.3.2.1d 代表株A/Chicken/Liaoning/SD007/2017（H5N1）（简称CK/LN/SD007）由本实验室分离保存；DEV 疫苗株AV1222 购自中国兽医药品监察所；DEV 强毒AV1221 株购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）；9 日龄～10 日龄SPF 鸡胚和SPF 鸭购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.2 主要试剂H5 亚型（CK/LN/SD007）HA 单因子血清由本实验室制备保存；红外标记驴抗鸡IgG 购自LI-COR 公司；FITC 标记兔抗鸡的IgG 购自Sigma公司；Gateway 试剂盒和ProFection Mammalian Trans⁃fection System-Calcium Phosphate 购 自Invitrogen 公司；Q5 High-Fidelity DNA Polymerase、限制性内切酶Mlu I、Sal I、SbfI-HF 和T4 DNA Ligase 购自NEB公司；EPI300-T1 cells 及fosmid 高拷贝诱导剂购自Epicentre 公 司；Plasmid Midi Kit 购 自Qiagen 公 司；胶回收试剂盒、DH5α 感受态细胞、病毒DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 重组粘粒构建以重组质粒pBD-LN/SD007HA为模板，采用引物5'-CGACGCGTGCCACCATGGAAA AAATAGTT-3'/5'-GCGTCGACTTAAATGCAAATTCTG-3'，PCR 扩增HA 基因，扩增产物经Mlu I 和Sal I 酶切后克隆至pENTR-SV40 质粒中，构建重组质粒pENTR-H5-12，并用PCR 和测序鉴定；按Gateway试剂盒操作方法，将pENTR-H5-12 和粘粒pFosTus78-ccdB K+反应，构建重组粘粒，采用PCR 和测序对重组粘粒鉴定。

1.4 重组病毒的拯救及遗传稳定性鉴定重组粘粒pFosT-us78H5-12 和pFosD、pFosH、pFosJ、pFosQ经Sbf I-HF 酶切处理后，参照磷酸钙转染方法将其共转染次代鸡胚成纤维细胞（CEF），待其出现细胞病变（CPE）时收集细胞和培养液，将培养液传至15代；提取第5、10、15 代培养液和亲本DEV 疫苗株的总DNA，利用引物5'-ACGCAAATTATGTCGTTG TT-3'/5'-TTGAGGTTCCGTAGTCTGG-3'进 行PCR 鉴定，分析重组病毒拯救情况，将拯救的重组病毒命名为rDEV H5-12；同时将扩增产物测序鉴定，分析重组病毒的遗传稳定性。

1.5 重组病毒间接免疫荧光（IFA）和western blot鉴定分别将第15 代重组病毒和亲本DEV 疫苗株以MOI 0.01 接种次代CEF，培养24 h～36 h 后，以H5 亚型AIV HA 单因子血清（1∶200）为一抗，FITC标记的兔抗鸡IgG（1∶1 000）为二抗，进行IFA 鉴定。分别将第5、10、15 代rDEV H5-12 和亲本DEV疫苗株以MOI 0.01 接种次代CEF，待CPE 至70%～80%收集细胞样品，以H5 亚型AIV HA 单因子血清（1∶400）为一抗，红外标记的驴抗鸡抗体（1∶1 000）为二抗，进行western blot 鉴定。

1.6 重组病毒生长曲线滴定将第15 代重组病毒和亲本DEV 疫苗株分别以MOI 0.01 接种次代CEF，在接种后24 h、48 h、72 h、96 h 收集病毒液，10倍倍比稀释（10-2～10-9）后，接种至96 孔细胞培养板生长良好的次代CEF 中，检测不同时间点rDEV H5-12 和DEV 疫苗株的TCID50，绘制生长曲线。

1.7 重组病毒免疫效力评价将40 只2 周龄SPF 鸭随机分为5 组，8 只/组，按表1 进行分组和免疫。A组和B 组免疫2 周后分别利用DEV 强毒（AV1221）和AIV 强毒（CK/LN/SD007）攻击，即将100 LD50的DEV经肌肉注射攻毒，106EID50的AIV 经滴鼻攻毒，AIV攻毒试验在生物安全三级实验室（P3）负压隔离器中进行。攻毒后，观察并记录14 d 内鸭子发病和死亡情况。其中，在AIV 强毒攻击后第3 d、5 d、7 d 采集喉头和泄殖腔拭子，接种鸡胚进行病毒的排毒检测[8]。C 组自首免后每周采血分离血清，利用血凝抑制（HI）试验进行HI 抗体效价检测。

表1 动物实验设计Table 1 The animal experiment design

2 结 果

2.1 重组粘粒鉴定结果将构建的重组质粒pEN⁃TR-H5-12 与pFosT-us78-ccdB K+作用，构建重组粘粒，重组粘粒经PCR 和测序鉴定。结果显示，重组粘粒经PCR 扩增获得4 389 bp 的核酸产物和414 bp的空载体pFosT核酸产物（图1A）。测序结果显示，HA基因无突变。表明构建了重组粘粒，命名为pFosTus78H5-12。

2.2 重组病毒遗传稳定性鉴定结果将pFosTus78H5-12 与DEV 疫苗株拯救系统的其它4 粘粒转染次代CEF，待其出现CPE 后，对培养液传至15代，分别提取第5、10、15 代培养液和亲本DEV 疫苗株总DNA 进行PCR 鉴定。结果显示，不同代次培养液的PCR 扩增均获得4 389 bp 的核酸产物，亲本DEV 疫苗株获得414 bp 的核酸产物（图1B）。测序结果显示，在DEV 疫苗株基因组中插入的HA 基因无突变。且HA 基因能在DEV 疫苗株基因组中稳定存在，表明构建了重组病毒，命名为rDEV H5-12。

图1 重组粘粒（A）和rDEV H5-12遗传稳定性（B）的PCR鉴定结果Fig. 1 Identification of recombinant cosmid (A) and rDEV H5-12(B) by PCR

2.3 rDEV H5-12 IFA和western blot鉴定结果rDEV H5-12 和亲本DEV 疫苗株接种的次代CEF 经IFA 鉴定结果显示，在rDEV H5-12接种的CEF中可观察到绿色荧光，而DEV 疫苗株接种的CEF 中无荧光（图2）。Western blot鉴定结果显示，第5、10、15代rDEV H5-12 接种的CEF 样品中均检测到76 ku 左右蛋白条带，而DEV 疫苗株接种的CEF 样品中无该条带（图3）。表明，HA基因在rDEV H5-12 中能够正确表达。

图2 rDEV H5-12 HA 蛋白表达的IFA 检测结果Fig. 2 Identification of rDEV H5-12 by IFA

2.4 rDEV H5-12 生长曲线测定结果rDEV H5-12和亲本DEV 疫苗株以MOI 0.01 接种次代CEF，接种后每隔24 h 收获病毒，并检测其TCID50，绘制生长曲线。结果显示，rDEV H5-12 和DEV 疫苗株在CEF中的增殖曲线相似，各时间点的病毒滴度无显著性差异（图4）。表明，在CEF 中rDEV H5-12 具有与DEV 疫苗株相同的增殖能力。

图3 rDEV H5-12 的western blot 鉴 定 结 果Fig. 3 Identification of rDEV H5-12 by western blot

图4 rDEV H5-12 和DEV 疫苗株在CEF 中的生长曲线Fig. 4 Growth curves of rDEV H5-12 and DEV vaccine strain in CEF

2.5 rDEV H5-12 免疫效力评价结果A 组为检验rDEV H5-12 的免疫效力试验组，分为rDEV H5-12免疫组和PBS 对照组。A 组SPF 鸭免疫两周后经DEV 强毒攻击，观察14 d，并记录发病死亡情况。结果显示，在观察期内，rDEV H5-12 免疫组鸭无发病、无死亡，对照组鸭在感染DEV 后6 d 内全部死亡（图5A）。表明，rDEV H5-12 免疫SPF 鸭后，能诱导针对DEV 强毒的完全免疫保护。

B 组为检验rDEV H5-12 对AIV 攻毒的免疫效力试验组，分为rDEV H5-12 免疫组和PBS 对照组。B组SPF 鸭免疫两周后经AIV 强毒攻击，观察14 d，并记录发病死亡情况。结果显示，在观察期内，rDEV H5-12 免疫组鸭无发病、无死亡，对照组鸭在感染AIV 强毒后5 d 内全部死亡（图5B）；在攻毒后第3 d、5 d、7 d 采集喉头和泄殖腔拭子（死亡的SPF鸭不再采集），病毒检测结果显示，rDEV H5-12 免疫组SPF 鸭在攻毒后第3 d、5 d、7 d 采集的喉头和泄殖腔拭子中均未检测到病毒，而对照组SPF 鸭采集的喉头和泄殖腔拭子中均能检测到较高滴度病毒（图5C、5D）。表明，rDEV H5-12 免疫SPF 鸭后，能诱导针对CK/LN/SD007（H5N1）的完全免疫保护。

2.6 rDEV H5-12 免疫鸭后的HI 抗体检测结果C组为rDEV H5-12 免疫后HI 抗体检测组。C 组SPF 鸭于2 周龄时首免，5 周龄时加强免疫，首免后每周收集血清检测HI 抗体，直至首免后第10 周。结果显示，rDEV H5-12 免疫组SPF 鸭在首免后2 周检测到HI 抗体，加强免疫后1 周达到高峰（HI 抗体最高达25），随后HI 抗体缓慢下降，至加强免疫后第7周，37.5%的鸭HI 抗体仍为阳性（图6）。表明，rDEV H5-12 免疫SPF 鸭后能够诱导其产生良好的HI抗体。

图5 rDEV H5-12 对DEV 和AIV 的 保 护 效 力Fig.5 Protective efficacy of the rDEV H5-12 against DEV and AIV

图6 rDEV H5-12 免疫鸭后HI 抗体检测结果Fig. 6 Detection of HI antibody titers after twice immunizations in ducks

3 讨 论

鸭瘟是危害我国养禽业的重要疫病，其弱毒疫苗自上世纪60 年代沿用至今，应用广泛，具有良好免疫保护效果，是理想的重组病毒载体[9-11]。由于AIV 抗原不断变异，导致防控AI 的疫苗株随之不断更新。我国2004 年至今先后研制出H5 亚型重组AIV Re-1～Re-12 株等灭活疫苗。与灭活疫苗相同，AIV 抗原的变异也要求防控AI 的活载体疫苗株不断更新。由此，本研究室基于前期构建的DEV 疫苗株多片段拯救系统平台，对重组DEV 载体活疫苗种毒进行更新。

前期研究在DEV 疫苗株复制非必需区（US7～US8 之间）插入HA 基因表达框构建的表达H5 亚型AIV HA 基因重组DEV 载体活疫苗（rDEVus78HA）能诱导对DEV 强毒和AIV 强毒良好的免疫保护。随后，围绕DEV 疫苗株US7～US8 基因之间表达外源基因的研究成为热点，本研究构建的rDEV H5-12 也取得良好的免疫保护效果，以上结果证明DEV 疫苗株基因组US7～US8 之间是可供外源基因稳定表达的良好位点。近年来，随着对DEV 基因组研究的深入，一些新的复制非必需区相继被筛选出来，例如赵玉博等鉴定出UL44.5 和UL44 基因间隔区为DEV基因组复制非必需区[12]，胡玉珍等获得了两个DEV基因组复制非必需区，分别位于US7 基因内部、US8 和US1 基因之间[13]。由于DEV 疫苗株存在多个可供外源基因插入的位点，那么我们有理由设想构建重组DEV 多联活疫苗，为水禽流感或者其它动物疫病的防控提供新思路。但是，DEV 疫苗株能否同时承载多种外源基因的表达，外源基因之间是否会相互影响，仍是一个未知但极具实际意义的研究方向，需要进一步实验探究。

本研究结果显示，在攻毒试验中，rDEV H5-12一次免疫SPF 鸭2 周后，对于DEV 强毒和AIV 强毒的攻击，免疫组无发病，无排毒，无死亡，对照组鸭排毒并全部死亡，表明rDEV H5-12 在SPF 鸭中诱导产生的抗体可以有效阻止病毒感染宿主细胞或病毒在体内的复制。另外，本实验对攻毒前SPF 鸭血清检测HI 抗体，发现免疫组SPF 鸭有1 只未检测到HI 抗体（文中未列出），但是仍然能够抵御DEV 和AIV 强毒的攻击，提示rDEV H5-12 不仅能够诱导SPF 鸭体液免疫应答，而且也能诱导细胞免疫应答，与之相关的研究应做相应跟进。在SPF 鸭HI 抗体检测试验中，rDEV H5-12 免疫SPF 鸭后能够诱导良好的HI 抗体，表明rDEV H5-12 中的HA 基因在SPF 鸭体内正确表达，其产物HA 蛋白被机体获得性免疫系统识别，诱导了体液免疫应答，产生了特异性抗体。另外，在10 周的观察期内，有8 周HI 抗体为阳性，表明以DEV 疫苗株为载体构建的活疫苗能够达到理想的免疫效果，提示以DEV 疫苗株为载体研制其它重要动物疫病疫苗具有可行性。

综上所述，本研究构建了表达2.3.2.1d 分支H5亚型AIV HA 基因的重组鸭瘟病毒（rDEV H5-12），可作为同时防控鸭瘟和水禽流感的二联活疫苗候选株，为DE和水禽AI的免疫防控提供了新途径。