川芎嗪改善缺血再灌注诱导的大鼠急性肾损伤

王树森，郑 越

（1.河北北方学院药学院，河北 张家口 075000；2.中国人民解放军总医院第八医学中心卫勤部，北京100089）

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是常见的临床综合征之一，已成为世界范围内的一个公共卫生问题。FENG等［1］在一项纳入765项研究、样本量超过7700万（迄今为止最大）的AKI荟萃（Meta）分析显示，住院患者AKI发病率和病死率均为21%。因此，AKI的发病机制及其治疗方法的探索是近年来研究的热点之一，并具有重要的临床和社会意义。

目前认为，AKI主要与血流动力学紊乱、内皮损伤、上皮细胞损伤以及这些因素之间复杂的相互作用而导致的强烈促炎状态有关［2］。导致AKI的原因有多种，其中肾缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤是一个重要原因［3］。川芎是我国传统中草药，具有活血化瘀、行气止痛的作用，川芎的主要有效化学成分为川芎嗪（tertramethylpyrazine，TMP）。TMP可有效治疗脑I/R损伤，并且已经广泛用于治疗血管疾病［3］。TMP不仅可以抑制细胞内钙释放，清除氧自由基，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase activity，SOD）活性，还可调节血液流变的稳定性［3-5］。研究报道，TMP可通过增加线粒体超氧化物歧化酶活性减轻细胞损伤［6］。关于AKI的发病机制有多种，ISHIMOTO等［7-8］报道，线粒体自噬可以在AKI中发生。线粒体自噬主要通过巨自噬清除多余和受损的线粒体。在哺乳动物细胞中，磷酸酶及张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologues，PTEN）诱导的激酶 1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）/E3泛素连接酶（Parkin）信号通路是参与哺乳动物线粒体自噬调控的主要机制之一。Parkin由PINK1激活后，转移至损伤线粒体，激活线粒体自噬，对受损线粒体清除并对线粒体进行质量控制，维持肾细胞的稳态［9］。目前，对肾病线粒体的研究少见报道，且一些针对线粒体的药物已经在其他领域得到应用。本课题组前期研究表明，TMP可以改善I/R导致的AKI，但其机制尚未明确［25］。因此，本研究探讨TMP改善I/R及与线粒体自噬的相关性，为TMP更好地应用于临床提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂和主要仪器

SPF级Wistar大鼠48只（体质量250～320 g），购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心〔SCXK（辽）2015-0001〕，大鼠在通风良好、温度20～25℃、湿度50%～60%的环境中饲养，自由饮食饮水。盐酸TMP注射液购于北京市永康药业有限公司（H11020960）。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）试剂盒购于美国BD公司；HE染色试剂盒和DAB显色液购自上海碧云天生物公司；兔抗大鼠PINK1多抗（一抗）、兔抗大鼠Parkin多抗（一抗）、生物素标记的山羊抗兔IgG抗体（二抗）和辣根过氧化物酶标记链霉卵蛋白素均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；血清肌酐（creatinine，Cr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量测定试剂盒及SOD活性测定试剂盒购于南京建成海浩生物科技有限公司。酶标仪（680，美国Bio-Rad公司）；包埋机（JB-L5）和切片机（RM 2126）（德国徕卡有限公司）；组织处理器（美天旎gentle MACS，上海宾智科技有限公司）；全自动生化分析仪（7600型，日本日立公司）。

1.2 大鼠急性肾损伤模型制备

48只Wistar大鼠随机分为6组，每组8只，分别为正常对照组、模型组、模型+TMP（10，15和20 mg·kg-1）组及正常+TMP（15 mg·kg-1）组。正常对照组仅开腹刺激双侧肾，开腹夹闭双侧肾动脉45 min再灌注30 min诱导大鼠AKI模型；模型+TMP组开腹夹闭双侧肾动脉45 min再灌注30 min后一次性ip给予不同浓度TMP；正常+TMP（15 mg·kg-1）组开腹刺激双侧肾脏75 min后一次性ip给予TMP15 mg·kg-1。各组缝合关腹24 h后，腹主动脉取血，将大鼠双侧肾完全剪下，部分肾组织固定于4%多聚甲醛中，其余冻存于-80℃超低温冰箱用于检测PINK1和Parkin蛋白。

1.3 血清Cr和BUN含量测定

实验结束时，取大鼠肾动脉血，4℃，2000×g离心，取上清。肌氨酸氧化酶法测定血清Cr含量，尿素酶-谷氨酸脱氢酶法测定BUN含量。使用日立7600型全自动生化分析仪测定。

1.4 血清TNF- α含量、肾组织SOD活性和MDA含量测定

实验结束时，取大鼠肾动脉血，4℃，2000×g离心，取上清。从-80℃冰箱内取出肾组织标本，称取0.5 g，在冰上用小剪刀剪开肾组织，按肾组织∶水=1∶9（V/V）的比例置于0℃生理盐水4.5 mL中，制备10%肾组织匀浆。ELISA法测定血清中TNF-α含量，WST-1法测定肾组织匀浆中SOD活性，TBA法测定肾组织匀浆中MDA含量。

1.5 HE染色检测肾组织病理变化

取相同部位肾组织固定于4%多聚甲醛中，石蜡包埋，切片机切至4 μm的切片，常规HE染色后，光学显微镜下观察、拍照记录。

1.6 免疫组织化学法检测肾组织PINK1和Parkin蛋白表达水平

取肾组织石蜡切片，进行免疫组织化学染色：石蜡切片脱蜡修复后，切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温15 min，加入兔抗大鼠PINK1多抗或兔抗大鼠Parkin多抗（一抗，稀释倍数均为1∶65），4℃孵育过夜；洗涤后滴加生物素标记的山羊抗兔IgG抗体（二抗），37℃静置20 min；洗涤后加入辣根过氧化物酶标记链霉卵蛋白素工作液，37℃作用15 min；洗涤后滴加DAB显色液避光显色，苏木精复染，中性树脂封片。显微镜拍照，观察记录。阳性表达标准参照XU等［26］方法，采用图像分析软件Image-pro Plus对PINK1和Parkin蛋白水平进行半定量分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 TMP对I/R致AKI模型大鼠肾功能和氧化应激的影响

模型组大鼠血清Cr和BUN较正常对照组显著增加（P＜0.01）；肾组织SOD活性降低（P＜0.01），MDA含量升高（P＜0.01）；与模型组相比，模型+TMP 10，15和20 mg·kg-1组大鼠血清Cr和BUN显著降低（P＜0.01，P＜0.05）；肾组织SOD活性增强（P＜0.01），MDA含量降低（P＜0.01），提示TMP可显著改善AKI模型大鼠的肾功能和氧化应激反应。正常+TMP 15 mg·kg-1组上述指标与正常对照组相比，无明显变化（表1）。

2.2 TMP对I/R致AKI模型大鼠肾组织结构的影响

如图1所示，正常对照组大鼠肾组织中肾细胞排列整齐，肾小管结构完整；模型组肾小管上皮细胞出现空泡样变性，刷状缘脱落，肾小管管腔中存在大量蛋白管型等；模型+TMP 10，15和20 mg·kg-1组蛋白管型和细胞坏死范围均明显减少，部分可见双层新生细胞，表明TMP能显著改善大鼠AKI。正常+TMP 15组肾组织中肾细胞排列整齐，肾小管结构完整，表明TMP对正常大鼠肾组织无副作用。

2.3 TMP对I/R致AKI模型大鼠血清TNF- α水平的影响

模型组大鼠血清TNF-α含量较正常对照组显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，模型+TMP 10，15和20 mg·kg-1组血清TNF-α含量显著降低（P＜0.01，P＜0.05）。正常+TMP 15 mg·kg-1组与正常对照组相比差异无统计学意义（图2）。

Fig.1 Effect of TMP on kidney histopathoIogicaI changes in I/R-induced AKI modeI rats by HE staining.See Tab.1 for the rat treatment.The black arrow shows protein tube type；the red arrow shows double-layered newborn cells.

Fig.2 Effect of TMP on serum tumor necrosis factor- α（TNF- α） content of I/R-induced AKI modeI rats.See Tab.1 for the rat treatment.±s，n=8.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

Tab.1 Effect of tertramethyIpyrazine（TMP） on IeveIs of serum creatinine（Cr）,bIood urea nitrogen（BUN）,superoxide dismutase activity（SOD）and maIondiaIdehyde（MDA）content in kidney tissue of ischemia/reperfusion（I/R）-induced acute kidney injury（AKI）modeI rats

2.4 TMP对I/R致AKI模型大鼠肾组织PINK1和Parkin蛋白表达水平的影响

如图3所示，正常对照组大鼠肾细胞结构正常，肾小管结构完整，仅见少量PINK1蛋白表达，且主要表达于胞浆；模型组大鼠肾组织中PINK1蛋白阳性表达较正常对照组显著减少（P＜0.01），肾小管结构不完整细胞排列紊乱；与模型组比较，模型+TMP 10，15和20 mg·kg-1组PINK1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），其中15mg·kg-1组升高最明显，同时肾细胞形态和结构明显改善。正常+TMP 15 mg·kg-1组肾细胞结构正常，仅见少量PINK1蛋白表达。

Fig.3 Effect of TMP on protein expression of induced putative kinase 1（PINK1）in I/R induced AKI modeI rats observed by immuno-histochemistry.See Tab.1 for the rat treatment.IA：integrated absorbance.The red arrow shows PINK1 positive staining.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=8.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

如图4所示，正常对照组大鼠肾细胞结构正常，肾小管结构完整，仅见少量Parkin蛋白表达，且主要表达于胞浆；模型组大鼠肾组织中Parkin蛋白阳性表达较正常对照组显著减少（P＜0.01），肾小管结构不完整细胞排列紊乱；与模型组比较，模型+TMP 10，15和20 mg·kg-1组Parkin蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），其中15 mg·kg-1组升高最明显，同时肾细胞形态结构明显改善。正常+TMP 15 mg·kg-1组肾细胞结构正常，仅见少量Parkin蛋白表达。

Fig.4 Effect of TMP on protein expression of Parkin in I/R induced AKI modeI rats observed by immunohistochemistry.See Tab.1 for the rat treatment.The red arrow shows Parkin positive staining.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=8.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

3 讨论

AKI是一种临床常见危重症，是住院患者较为严重的并发症之一，其发生率呈上升趋势，在临床危重患者中的发病率达＞21%且死亡率较高［10-12］。川芎的主要成分TMP对肾I/R损伤等具有明显的疗效，与传统中医记载的川芎具有活血化瘀功效一致。现代药理学研究表明，TMP对I/R导致的AKI具有显著的修复和保护作用。

血清Cr和BUN是公认的衡量肾损伤程度的指标，正常情况下其含量较低，但在肾功能受损时含量显著升高。组织匀浆中SOD活性和MDA含量与肾损伤程度相关，通过检测SOD和MDA的水平也可以反映肾损伤的程度［13-16］。TNF-α是一种细胞活化产生的细胞因子，广泛参与机体的细胞免疫、炎症反应以及肿瘤相关基因的调控，TNF-α可使内皮素合成增加，内皮素可引起肾小球滤过率和肾血流量显著下降和减少。因此，TNF-α含量可反映肾缺血情况，进而可间接评估AKI的严重程度。本研究结果显示，AKI模型大鼠肾细胞病变明显，肾小管细胞排列紊乱，可见大量蛋白管型，同时血清Cr，BUN和TNF-α水平升高，表明AKI模型大鼠肾功能受损。TMP能显著降低AKI模型大鼠血清Cr，BUN和TNF-α水平，明显改善AKI的病理，升高组织匀浆中SOD活性，同时降低MDA水平，减轻氧化应激反应对肾细胞的进一步损伤。此研究结果与王娜等［17］研究结果一致。

线粒体是机体重要的细胞器。目前研究表明，细胞凋亡、横纹肌溶解和I/R损伤等机制与AKI密切相关［8，18］。THOMAS等［9］研究发现，线粒体功能障碍是肾病发病机制中的一个重要因素。线粒体功能障碍时，产生活性氧，释放某种活性物质，诱导细胞凋亡，两者均可促进多种疾病的发生发展［7，20］。这很可能是诱导肾小管细胞损伤的重要原因［21］。线粒体作为ROS产生的主要场所，也易发生氧化损伤和应激［22］，均是加重AKI的关键因素。因此，及时清除受损的线粒体是一种有效的保护途径。研究报道，PINKl/Parkin途径是介导线粒体自噬的主要信号通路［23-24］。TMP作为一种单体成分，阐明其确切的靶点对治疗AKI药物的开发也有重要意义。本研究结果显示，TMP可以上调AKI模型大鼠肾组织PINK1和Parkin蛋白的表达。免疫组织化学染色结果也显示，AKI模型组肾组织PINK1和Parkin蛋白表达极少，TMP可以上调PINK1和Parkin蛋白表达水平，从而促进线粒体自噬，发挥肾保护作用。

综上所述，TMP对I/R诱导的AKI具有保护作用，其机制可能与改善氧化应激、上调PINK1和Parkin蛋白表达有关。进一步明确TMP保护AKI的作用机制，将为TMP用于AKI的治疗提供理论依据。