黄精地龙配伍对自然衰老小鼠学习记忆及海马神经凋亡的影响

钱红月，肖移生，侯吉华，姜劼琳

(江西中医药大学 中医学院，江西 南昌 330004)

机体进入老龄，记忆力会有不同程度的衰减，严重者可出现痴呆，记忆认识障碍是危害老年人健康的重要因素[1]。当前，人口老龄化已成为全球性社会问题，研发抗衰老、抗痴呆药物用于改善老年人记忆、认知功能已成为国际医药界研究的热点[2]。黄精地龙配伍为笔者团队中药配伍复方的重要成果之一，该配伍可改善造模性痴呆大、小鼠学习记忆功能，增加脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，减少丙二醛(MDA)含量，显示出良好的抗氧化、抗炎、降低神经中枢氧化应激水平的作用[3]，并可调控中枢神经胆碱能递质系统发挥抗痴呆作用[4-6]，且该配伍对体外培养分化的SH-SY5Y神经细胞Aβ25-35损伤具有良好的保护作用，促进SH-SY5Y神经细胞增殖，这与其具有抗氧化损伤、调控细胞内钙稳态等机制有关[7-8]。这些研究显示出黄精地龙配伍具有较好的神经保护作用。由此，可以推测该配伍也具有改善自然老龄动物学习记忆的功能。本课题拟观察黄精地龙配伍对自然老龄小鼠学习记忆及海马神经凋亡的影响，验证该配伍神经保护作用的可重复性及稳定性，并为其临床转化提供有价值的实验依据。

1 材料与试剂

1.1 实验动物与分组

40只SPF级、雄性、18月龄昆明小鼠(自然老龄小鼠，体质量(38±4)g)进入实验室后，适应性饲养1周，再随机分成老龄组、黄精地龙低、中、高剂量组(分别为2、4、8 g·kg-1·d-1剂量[3])，每组10只老龄小鼠；另有10只SPF级、雄性、2月龄昆明小鼠(体质量(22±2)g)设为青年对照组。所有动物由江西中医药大学实验动物中心提供(许可证编号：SYXK(赣)2017-0004)。本课题动物实验方案已由江西中医药大学实验动物伦理委员会审查通过(批准编号：20191025186)，研究中动物处置全过程严格遵守实验动物伦理学相关条例。

1.2 试验药物与试剂

黄精地龙配伍由酒黄精、炙地龙两味中药按质量1∶1组成，两味中药均购自江西中医药大学附属医院门诊中药房，经鉴定属合格品，符合国家中药临床应用标准；焦油紫为Solarbio公司产品；Bcl-2及Caspase-3兔抗小鼠一抗均为美国Invitrogen公司的产品；免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均为北京中杉金桥公司产品。

1.3 仪器

EX-TE-03小型中药提取罐(上海顺仪实验设备公司)，STRIKE 300型旋转蒸发仪(德国ChemTron公司)，DT-200型小鼠跳台仪(上海康为医疗公司)，BW100型旷场实验箱(荷兰Noldus公司)，BX-41型显微数码系统(日本Olympus公司)，Motic Image Advanced3.2图像数据分析软件(德国Motic公司)。

2 方法

2.1 试验药液提取制备

按本课题组成熟的方法提取黄精地龙配伍药液[3-7]，即称取黄精、地龙各200 g，混合后粉碎，加10倍量的蒸馏水充分浸泡，加热后沸水回流1 h，滤过，收集药液；向药渣内再加3倍量蒸馏水，并再次沸水回流30 min，滤过，收集药液；合并两次提取药液后进行离心；取上清药液再浓缩成200 mL药液(每1 mL相当于含生药1 g)。

2.2 实验动物干预

黄精地龙低、中、高剂量组各小鼠分别灌胃2、4、8 g·kg-1·d-1黄精地龙浓缩提取液，老龄组各小鼠灌胃0.5 mL·d-1生理盐水。以上各组小鼠连续灌胃干预4周，4周后进行各指标检测。青年对照组小鼠无特殊干预，仅日常饲养。

2.3 跳台试验

参考本课题组常用的跳台试验方法进行[3-4]。即实验分训练和测验两部分进行，训练时先将小鼠放入反应箱内适应3 min，然后立即通以36 V交流电，动物受到电击后跳上平台以躲避电击为正确反应，如再次跳到铜栅上受到电击，即为错误反应。如此训练5 min，由系统自动记录每只小鼠受电击后跳上平台的反应时间及跳下平台受电击的错误反应次数，作为学习成绩。24 h后再做测验，测验时将小鼠平稳放在跳台上，记录第一次跳下平台的潜伏期和5 min内错误反应次数，作为动物的记忆保持能力。若5 min内小鼠未跳下平台，潜伏期按300 s计算。

2.4 旷场试验

旷场实验箱为一长、宽、高为55 cm×55 cm×30 cm的装置，正上方2 m处有红外摄像头，视野可覆盖整个旷场，底面被平均分成25个小格，中间9个小格为中央区，其余16个小格则为周围区。实验开始时，将小鼠置于旷场的正中央，让其自由探索10 min，由系统自动记录并进行分析，计算小鼠在中央区的活动时间以及10 min内的活动总路程，重复检测3次。本实验需在安静、回避人的实验室内进行，且每只小鼠实验结束后，均需用酒精擦拭旷场，以消除气味对实验结果的干扰。

2.5 取材

完成旷场实验后次日，深度麻醉小鼠后由心脏左心室内灌注4%多聚甲醛固定，再取出大脑置于4%多聚甲醛再固定48 h(4 ℃)，进行常规石蜡包埋，行冠状位连续切片，用于海马尼氏染色及免疫组化染色。

2.6 尼氏染色

海马切片晾干后置于0.1%的焦油紫溶液中37 ℃染色5 min，蒸馏水冲洗；95%酒精分化，蒸馏水冲洗；梯度酒精(70%→80%→90%→95%I→95% II→100% I→100%II)各3 min脱水，二甲苯I、二甲苯II透明各3 min，中性树胶封片；光镜下观察各组小鼠海马CA1、CA3区神经元形态学、数量等的变化。神经元计数方法：于10×40倍光镜下，每一脑片随机选取相邻3个视野，镜下面积为4.5×10-2mm2，运用 Motic 数据分析软件计数神经元，结果取平均值。

2.7 免疫组化染色

免疫组化染色步骤按试剂盒推荐的SP法操作，使用的一抗有Bcl-2及Caspase-3抗体(1∶500)。同尼氏染色的神经元观察与计数方法，光镜下观察各组小鼠海马CA1、CA3区免疫阳性神经元并计数。

2.8 统计方法

3 结果

3.1 各组小鼠跳台试验的学习和记忆成绩比较

与青年对照组比较，老龄组小鼠学习反应时间明显延长，记忆潜伏时间明显缩短，学习与记忆成绩的错误次数明显增多(P<0.01)；与老龄组比较，黄精地龙低、中、高剂量组小鼠学习反应时间缩短，记忆潜伏时间延长，学习与记忆成绩的错误次数减少(P<0.05，P<0.01)，且随药物剂量增加，效果越明显(量效关系明显)。见表1。

表1 各组小鼠跳台试验的学习和记忆成绩比较

3.2 各组小鼠旷场试验的中央区活动时间和活动总路程的比较

与青年对照组比较，老龄组小鼠中央区活动时间及活动总路程均明显缩短(P<0.01)；与老龄组比较，黄精地龙低、中、高剂量组小鼠的中央区活动时间及活动总路程均明显变长(P<0.05，P<0.01)，且量效关系明显。见表2。

表2 各组小鼠旷场试验的中央区活动时间和活动总路程的比较

3.3 各组小鼠海马尼氏染色CA1、CA3区神经元数量比较

与青年对照组比较，老龄组小鼠海马CA1、CA3区神经元数量均明显减少(P<0.01)；与老龄组比较，黄精地龙低、中、高剂量组小鼠海马CA1、CA3区神经元数量均明显增多(P<0.05，P<0.01)，且量效关系明显。见表3。

表3 各组小鼠海马尼氏染色CA1、CA3区神经元数量比较

3.4 各组小鼠海马CA1及CA3区的Bcl-2、Caspase-3阳性神经元数量比较

与青年对照组比较，老龄组小鼠海马CA1与CA3区的Bcl-2免疫阳性神经元数量明显降低、Caspase-3免疫阳性神经元数量明显升高(P<0.01)；与老龄组比较，黄精地龙低、中、高剂量组小鼠海马CA1与CA3区的Bcl-2免疫阳性神经元数量明显升高、Caspase-3免疫阳性神经元数量明显降低(P<0.05，P<0.01)，且量效关系明显。见表4。

表4 各组小鼠海马CA1及CA3区的Bcl-2、Caspase-3阳性神经元数量比较

4 讨论

衰老是生命后期阶段进行的全身性、多方面、复杂的退化过程，涉及全身多功能系统，尤其是中枢神经系统的衰老更明显，会出现日益严重的记忆认知功能障碍[9]。在脑组织的衰老过程中，总是伴随着一定量的神经元凋亡，导致神经元数量逐渐减少，从而引发脑部功能逐渐减退。机体的大脑海马区是管理学习、记忆、认知功能的重要结构。大量的基础研究和临床研究表明，大脑海马区是衰老、痴呆病变的主要部位之一，如海马萎缩、神经元变性、丢失等[10-11]。实验动物大脑海马区受损伤可引起动物记忆、认知功能障碍，且严重程度与损伤度成正比[12]。临床也发现，颅内肿瘤患者接受射线照射治疗时，海马辐射剂量越大，患者的记忆、认知障碍越严重[13]。本课题组前期研究也发现，老年痴呆大鼠的海马病变明显，结构萎缩模糊，神经元数量明显减少[5-6]。因此，在防治衰老、痴呆的课题中，对海马神经保护研究的意义重大。本课题发现，衰老小鼠的学习、记忆、认知功能明显减退，这与其大脑海马各区神经元数量减少有关。黄精地龙配伍可保护海马神经，能明显升高衰老小鼠海马各区神经元数量，进而改善衰老小鼠的学习、记忆、认知功能，且呈现明显的药效关系。这与本课题组前期有关黄精地龙配伍抗大、小鼠老年痴呆的研究结果类似[3-6]。这些研究表明，黄精地龙配伍具有较好的防治老年痴呆、抗衰老的作用，其神经保护作用较明显，且其有效性、重复性、稳定性均佳，具备临床应用的实验研究基础。

机体一旦衰老，往往会出现一定程度的焦虑精神状态，并伴随着自发活动能力与探索行为能力的衰减[14-15]。旷场实验箱是检测动物焦虑程度、自发活动与探索行为能力的有效设施，小鼠在旷场中央区的活动时间反映其焦虑程度，中央区活动时间越长，焦虑程度则越低。小鼠的活动总路程长短可反映其自发活动能力与探索行为能力的强弱。本课题显示，黄精地龙配伍可降低衰老小鼠的焦虑程度，提高其自发活动能力与探索行为能力。这表明，该配伍可缓解老年个体的精神焦虑状态，调节其神经心理功能。

Bcl-2为关键的凋亡抑制基因，在维持细胞存活中发挥着重要作用，而Caspase-3则为重要的凋亡执行基因，细胞内此二者的表达活性状态对细胞的抗凋亡与凋亡影响至关重要[16]。本课题还发现，衰老小鼠海马各区Bcl-2表达明显下降，Caspase-3表达明显上升，这表明海马神经元凋亡是导致衰老小鼠海马神经元数量减少的重要因素。黄精地龙配伍能有效升高衰老小鼠海马神经元Bcl-2表达、降低Caspase-3表达，发挥重要的抗海马神经元凋亡作用。由此可知，黄精地龙配伍抗痴呆、抗衰老的作用与其通过抗神经细胞凋亡机制发挥神经保护的作用有关。

中医对人体衰老或早衰的认识源远流长，中医理论认为衰老是由机体阴阳失调、精气亏耗、脏腑虚衰、血瘀络滞所致，其中，当以“肾虚致衰”为根本。肾元之阳气和肾藏之精气亏损、虚少，则五脏之气血津液生化乏源，五脏气血津液生化无源则导致诸多衰老病态和衰老过程[17-18]。因此，针对衰老病机，中医采取补肾填精、益气健脾、活血通络、化痰开窍等治法抗衰老。黄精地龙配伍系本课题组依据中医理论的自创方，组方精炼，方中黄精具有补气养阴、健脾益肾等功效，常作食疗[19]。地龙具有平肝祛风、通经活络等功效，民间也可作食疗之用[20]，两者结合，既遵守中药组方原则，又符合中医药食同源学说，可针对衰老、痴呆病机进行辨证论治。本课题组实验已证实黄精地龙配伍抗衰老、抗痴呆的有效性和可重复性，在中医临床运用中也发现该配伍有效，但具体疗效尚需进一步验证。