基于网络药理学探讨生脉散治疗心律失常作用机制*

吕佳誉，崔向宁，苏文革

1.山东中医药大学，山东济南250014；2.中国中医科学院广安门医院，北京100053；3.山东中医药大学附属医院，山东济南250014

生脉散由人参、麦冬、五味子三味药组成，最早载于《医学启源》，后世亦称之为生脉汤、参麦散、生脉饮、定肺汤等。生脉散具有益气生津、敛阴复脉之效，是治疗气阴两虚证的经典方剂［1］。心律失常是心血管系统常见病症，严重者可危及生命。随着分子生物学和细胞电生理学技术的发展，心律失常的机制逐渐明晰，如KCND3钾离子通道基因与心肌早期复极化有关［2］，SCN5A钠离子通道蛋白与进行性恶性心律失常及扩张型心肌病［3］相关，连接蛋白43（Connexin-43，Cx43）脱磷酸作用会导致缺血/再灌注损伤心脏的心律失常和心肌细胞凋亡［4］，巨噬细胞的极化通过缝隙连接和KCa3.1激活导致心肌梗死后心律失常和异构复极化［5］，氧化应激可能导致心脏的结构重构和电重构，在心房颤动的发病机制中具有潜在作用［6］。

网络药理学在中医药研究领域的应用发展为药物的大数据管理、中药分子机制研究提供方便［7］，且能够预测中药复方治疗临床疾病的作用机制，筛选药物有效成分，节约药物研发费用［8］。生脉散在心血管疾病治疗中的运用和研究较多。Ma等［9］发现生脉散可对急性心肌梗死所致心力衰竭房颤大鼠通过肿瘤坏死因子-β1（tumor necrosis factor-β1，TGF-β1）途径抑制肌成纤维细胞分化、减少房颤的传导率和缩短房颤持续时间，Wu等［10］实验表明，生脉散可通过改善心肌梗死后心脏结构和减少Cx43的表达，降低心肌梗死大鼠心室颤动阈值等。为了深入探讨生脉散治疗心律失常的分子机制，本研究运用网络药理学方法构建“成分-靶点-通路”网络，分析生脉散治疗心律失常的潜在靶点及相关通路，为进一步研究提供思路和依据。

1 材料与方法

1.1 生脉饮药物成分筛选及靶点预测使用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）和中医药综合数据库（Traditional Chinese Medicines Integrated Database，TCMID）检索生脉散的化学成分，根据成分毒药物动力学（absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME）参数筛选生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，药物相似性（drug likeness，DL）≥0.18的主要活性成分，并对主要活性成分在TCMSP和STITCH网站中进行靶点预测，在Uniprot网站确定靶点的简称及编号。

1.2 心律失常疾病靶点检索在TTD、DRUGBANK及DisGeNET 3个常用疾病数据库中以“arrhythmic”作为关键词进行检索，在DisGeNET数据库中筛选出分值较高的靶点，与另外两个数据库检索出的靶点合并，去掉重复值，获得心律失常疾病靶点。

1.3 生脉饮、心律失常共同靶点获取及关键靶点的筛选将生脉饮的作用靶点和心律失常的疾病靶点录入VENNY2.0网站并绘制韦恩图（Venn diagram），获得心律失常疾病与生脉饮药物的共同靶点。将所得的共同靶点输入STRING平台，建立靶点间的相互作用网络关系图，利用STRING数据库筛选出最高置信度（得分0.900）的靶点作为关键靶点，得出关键成分。

1.4 构建“成分-靶点-通路”网络运用DAVID数据库对生脉散治疗心律失常的关键靶点进行KEGG和GO通路富集分析，筛选出P＜0.01的重要通路，将成分、靶点、通路运用Excel表格建立对应关系，导入Cytoscape3.2.1并运用Network Analyzer插件对网络进行分析，构建生脉散-心律失常的“成分-靶标-通路”网络图，根据关键参数自由度（degree）和介数（betweenness centrlity）进一步筛选关键通路。

2 结果

2.1 生脉饮有效活性成分及靶点使用TCMSP数据库检索人参、五味子的化合物，从TCMID数据库中检索麦冬的有效成分，将所有化合物根据设定的ADME参数筛选入血活性成分。人参22个，五味子8个，麦冬55个，删除重复项，生脉散主要成分有84个；将人参、五味子、麦冬的成分在TCMSP中进行靶点预测，并在Pubchem网站查找其化合物smile号，在STITCH网站根据score值筛选其作用靶点，得到预测靶点，人参99个，五味子22个，麦冬59个，去掉重复的靶点，故生脉散作用靶点为127个。

2.2 心律失常疾病靶点结果分析通过对TTD、DRUGBANK及DisGeNET 3个数据库进行“arrhythmia”关键词检索，TTD数据库检索到36个靶点，DRUGBANK数据库检索到108个靶点，DisGeNET数据库检索到589个靶点，在DisGeNET数据库选取靶点Score值高于平均值的靶点，共162个，与前两个数据库中的靶点合并，删除重复靶点后共获得心律失常疾病靶点180个。

2.3 共同关键靶点获取结果

2.3.1 生脉饮、心律失常共同靶点韦恩图使用VENNY2.1在线网页计算结果并绘制出韦恩图，得到人参、麦冬、五味子与心律失常各自共同靶点及各自所占比例，显示出生脉散与心律失常的共同关键靶点30个，见图1。

图1 生脉散与心律失常交集靶点韦恩图

2.3.2 关键靶点的筛选将2.3.1中筛选出的生脉散与心律失常共同靶点输入String数据库中，构建靶点间相互作用网络，见图2。设置highest confidence为0.9，分析得到23个关键靶点，关键成分19个，见表1。生脉散有效成分治疗心律失常的关键靶点，通过Cytoscape3.2.1形成网络图，见图3。

图2 生脉散治疗心律失常靶点功能相关网络图

2.4 构建成分-靶点-通路网络

2.4.1 富集通路分析及重要通路筛选将生脉散治疗心律失常的关键靶点导入DAVID数据库，做KEGG和GO通路分析，得到64个信号通路，根据P＜0.01筛选出36条重要通路，运用E Chart网站制作气泡图，见图4。点的颜色从绿色到红色代表P值从小到大，显示生脉散作用于心律失常通路主要富集于钙离子信号通路（Calcium signaling pathway）、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路（adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway）、环磷酸鸟苷（cyclic guanosinemonophosphate，cGMP）-PKG信号通路、环腺苷-3′，5′-磷酸（cyclic adenosinemonophosphate，cAMP）信号通路等，与交感神经反射、信号转导、离子通道等相关。

图3 生脉散重要成分-靶点网络图

图4 生脉散抗心律失常的通路富集分析

表1 生脉散治疗心律失常重要靶点及成分

2.4.2 成分-靶点-通路网络构建将筛选出的药物关键成分19个，共同关键靶点23个，关键通路35个，使用Cytoscape 3.2.1软件构建网络，见图5A。使用软件中的“Network Analyzer”插件进行分析，根据节点度值和介数值显示ADRB2、ADRA1B、ADRA1A、PTGS2、ADRA1D、ADRB1、CHRM3、CHRM1等靶点度值较高，根据度值、介数制作图5B，以节点大小代表度值大小，以颜色深浅代表介数大小；并将其中度值较高的10个关键通路列于表2。

表2 生脉散治疗心律失常重要通路

3 讨论

3.1 中医理论探讨中医学本无心律失常病名，因其临床常见心悸、胸闷、气短、惊慌不安等不能自主的自觉症状，并结合脉象的参伍不调，可参照中医的“心悸、怔忡”辨证论治［11］。其病因多为外感六淫、七情内伤、饮食劳倦、失治误治、药物影响等。病机现虚实两端，虚者为心脏或兼有其他脏腑的气血阴阳亏虚而致心神失养，实者为风、寒、热、痰、湿、气滞和血瘀致心神受扰［12］。生脉散中“人参之甘补气，麦门冬苦寒，泻热补水之源，五味子之酸，清肃燥金”（《内外伤辨惑论》），三者合用共奏大补上焦气阴之功，使得气充而脉复，故尤适宜于心悸、怔忡之气阴两虚者。临床统计表明，生脉散及其加减、合方在治疗各种心律失常方面有效，包括快速性心律失常［13］、缓慢性心律失常［14］、室性早搏［15］、房性早搏［16］、房颤［17］等及合并冠状动脉粥样硬化性心脏病、心力衰竭、风湿性心脏病、心肌炎等疾病。

3.2 多成分-多靶点-多通路治疗机制本研究通过TCMSP和TCMID数据库筛选出生脉散有效活性成分84个，可能治疗靶点127个，使用TTD、DRUGBANK及DisGeNET数据库检索出心律失常疾病靶点共180个，将药物靶点与疾病靶点进行韦恩图绘制，获得两者共同靶点30个。共同靶点输入String中，得到生脉散治疗心律失常靶点间相互作用网络，根据置信度筛选出生脉散治疗心律失常的关键靶点，如ESR2、SCN5A、CYP1A2、CYP2C19、MAOB、ADRA1A、MAOA、ADRB1、TNF、CHRM2、CHRM1、DRD1等共23个，关键成分19个，对关键靶点使用DAVID网站中的KEGG和GO通路富集进行分析，获得64条信号通路，根据P值筛选，得到钙离子信号通路（Calcium signaling pathway）、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路（adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway）、心肌细胞的肾上腺素能信号通路（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）等35条重要通路。通过使用Cytoscape 3.2.1构建“成分-靶点-通路”网络，显示生脉散具有多成分、多靶点、多通路的复方作用特点，不同靶点和通路共同发挥药效，具有治疗心律失常的重要潜力。

3.3 重要通路分析房性心律失常可由钙离子通路信号（Calcium signaling pathway）增加导致，心室重构亦与Ca2+信号系统有关［18］。大量临床试验研究表明，交感神经系统过度激活是引发室性心律失常和心脏性猝死的重要机制［19］，心肌间质中高浓度的肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺可导致心肌细胞钙超载和交感神经末梢本身的损伤，进而增加恶性心律失常的风险［20］。G蛋白家族与心血管疾病密切相关，G蛋白在心脏表达的亚型有Gs、Gi/o、Gq/11、G12/13等，参与心肌收缩力、心率、心律等调节［21］。腺苷酸环化酶（adenyl cyclase，AC）是G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）下游的关键信号分子［22］，可通过调节cAMP的浓度参与多种生理病理过程，Gsα可激活AC，通过ACcAMP-PKA通路介导β-肾上腺素受体的正性频率作用，还可通过cAMP直接作用于L型钙离子通道，参与内质网Ca2+的释放［23］，调节细胞内钙稳态；Giα介导M2-胆碱受体激动剂的钾离子通道激活，从而参与心率的调节。G蛋白偶联的信号传导系统（regulator of G-protein signaling system，RGSs）为作为治疗心律失常的重要靶向途径［24］。cGMP是细胞内介导一氧化氮和利钠肽作用的第二信使，细胞内cGMP水平升高，通过cGMP依赖蛋白激酶等发挥生理作用，PKG1亚型可使细胞内钙离子浓度降低，或使肌肉细胞对Ca2+的敏感性降低而导致平滑肌松弛。唾液分泌（Salivary secretion）受自主神经末梢释放的神经递质刺激而产生，交感刺激导致腺苷酸环化酶的激活和细胞内cAMP的积累，副交感神经刺激激活磷脂酶C，导致细胞内Ca2+升高，此通路虽与抗心律失常的治疗作用关系不甚密切，却提示药物可能带来的不良反应。现在许多抗心律失常药如普罗帕酮、地尔硫卓等均有口干等不良反应。

3.4 有效成分探讨通过Cytoscape 3.2.1软件构建“成分-靶点-通路”网络及“Network Analyzer”插件进行分析，得到度值及介数值较高的有效成分包括:豆甾醇（Stigmasterol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、苏齐内酯（suchilactone）、山奈酚（kaempferol）、灌木远志酮A（Frutinone A）、人参皂苷（ginsenoside rh2）、Fumarine、Inermin、Girinimbin、Gomisin R等，其中动物实验表明山奈酚可通过影响Ca2+转运蛋白减少应激诱导的室性心动过速的发作［25］，减少炎症和氧化应激，抑制血管紧张素II诱导的心脏纤维化和功能障碍［26］；人参皂苷rh2可通过清除大鼠心肌组织内ROS、提高抗氧化酶活性，从而降低大鼠体内氧化应激水平、改善大鼠心肌损伤［27-28］；β-谷甾醇可通过上调谷胱甘肽氧化循环实现对雌性大鼠的心肌保护作用［29］等。有效成分的分子机制，仍有待进一步实验研究和临床实践。