白花蛇舌草多糖对Lewis肺癌小鼠肿瘤抑制作用及机制研究*

贾羲，王娟，贾文瑞，聂安政

郑州大学第一附属医院，河南郑州450003

肺癌作为世界上最常见的恶性肿瘤之一，目前虽然以手术、放化疗、靶向治疗、生物治疗等为主的多种综合治疗方法使其疗效有所提高，但其5年生存率不足14%［1］。目前化疗是治疗肺癌主要措施之一，但化疗药品毒性强，甚至降低患者免疫功能。虽靶向药物的问世给肺癌的治疗带来了新的希望，而靶向药物的耐药性、不良反应成了困扰临床工作者的首要问题。因此，选择一种疗效显著、毒性低的化疗药物尤为重要［2-3］。近年来，中医药在肺癌靶向治疗的疗程中起着一定的作用，如减轻不良反应保证靶向治疗疗程的完整性、减轻肺癌症状改善生活质量、增强抗肿瘤疗效、逆转靶向药物耐药、提高生存率等方面与靶向治疗之间都存在明显的互补性［4-5］。白花蛇舌草是茜草科耳草属植物白花蛇舌草Oldenlandia diffusa（Willd.）Roxb.的干燥全草，味苦、甘，性寒，具有清热解毒、活血化瘀、利湿通淋等功效［6］，化学成分包括有黄酮、蒽醌、甾醇、多糖、萜类和脂肪族类化合物等。在临床治疗中，白花蛇舌草应用十分广泛，常用于多种肿瘤和自身免疫性疾病治疗［7］。癌症方面主要用于肝癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、卵巢癌等，但对肺癌的研究尚显不足。而多糖成分在肺癌方面研究尚未大规模研究［8］，研究者发现白花蛇舌草多糖能提高免疫抑制小鼠的免疫功能，对鼻咽癌CNE2细胞株增殖具有一定抑制作用［9］。在体外实验中，白花蛇舌草的乙醇提取物可以抑制HT-29肿瘤细胞的增殖，并诱导细胞凋亡，导致DNA碎裂，质膜不对称丢失，线粒体膜电位塌陷，活化Caspase 9和Caspase 3，激活促凋亡基因Bax，并下调Bcl-2、Cyclin D1、PCNA、CDK4的基因表达，表明白花蛇舌草可以通过多种途径对结直肠癌进行抑制［10-11］。此外，白花蛇舌草亲脂性提取物和粗多糖对S-180肿瘤细胞具有明显的抑制作用，在抑制肿瘤生长的同时，白花蛇舌草粗多糖对化学药物如环磷酰胺所致的免疫系统和造血系统损伤具有一定的保护作用［12］。由此可知，白花蛇舌草在抗肿瘤方面存在广阔前景。本研究通过建立Lewis肺癌小鼠模型，选取白花蛇舌草多糖为研究对象，观察其对Lewis肺癌小鼠肿瘤抑制作用及肿瘤组织中VEGF、HIF-1α、Bcl-2、Bax基因表达影响，为白花蛇舌草的全面开发利用提供依据，也为临床防止肺癌疾病提供用药依据。

1 材料

1.1 瘤株及动物Lewis肺癌细胞（Lewis lung cancer cell，LLC），上海斯信生物科技有限公司；SPF级6～8周龄C57BL/6J小鼠85只，雌雄各半，体质量19～22 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物生产许可证号:SCXK（鲁）20140007。

1.2 药物与试剂白花蛇舌草多糖，南京泽郎生物科技有限公司（白花蛇舌草g/水mL为1∶14，超声提取30～40 min，重复提取3次，合并上清液，旋转蒸发至原体积的1/4，sevage脱蛋白，加入乙醇，使乙醇浓度达到60%，静置4 h，析出多糖，质量分数达56%）；顺铂（DDP），江苏恒瑞，批号:20181021。白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）试剂盒（批号:E20190115），白细胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）试剂盒（批号:E20181216），肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor alpha，TNF-α）试剂盒（批号:E20181228），干扰素-γ（Interferon gamma，TFN-γ）试剂盒（批号:E20190117），血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）试剂盒（批号:E20181222），缺氧诱导因子（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）试剂盒（批号:E20181223），基质金属蛋白酶-2（Matrixmetalloproteinase 2，MMP-2）试剂盒（批号:E20190108），均购自苏州卡尔文生物科技有限公司；Trizol试剂（北京索莱宝科技有限公司，货号:15596-019）；逆转录试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号:RP1200）。

1.3 仪器全自动生化分析仪（南京贝登医疗股份有限公司，型号:BS200）；高速冷冻离心机（湖南湘仪，型号:TD5A-WS）；实时荧光定量聚合酶链式反应仪器（美国ABI公司，型号:7900HT）。

2 方法

2.1 细胞培养将肺癌细胞于10%胎牛血清的DMEM培养液中培养，37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱培养，隔天换液，进行培养，传代，胰蛋白酶进行消化，取对数期细胞进行实验。

2.2 模型制备及给药动物适应性喂养1周，动物随机分为空白组、模型组、顺铂组、白花蛇舌草多糖（高、中、低剂量）组，每组13只。空白组除外，其余各组小鼠于右腋皮下接种LLC悬液［13-14］，每只0.2 mL（细胞计数器选取活细胞数＞95%，浓度为1×107mL-1）。接种7 d后，选取造模动物右腋下形成瘤块者为成模动物，最终动物实验数确定为每组10只（确保每组成模动物数量统一）。各组小鼠给予相应药物，顺铂组腹腔注射6 mg·kg-1的DDP，隔日1次，白花蛇舌草多糖（灌胃剂量200 mg·kg-1、100 mg·kg-1、50 mg·kg-1），空白组及模型组给予同等体积生理盐水灌胃，每天给药1次，连续给药21 d。

2.3 血清指标检测各组动物于末次给药2 h后，腹主动脉取血，离心后取上清液，ELISA法检测血清中IL-2、IL-10、TNF-α、TFN-γ、VEGF、HIF-1α、MMP-2的水平。

2.4 抑瘤作用处死各组小鼠，取出完整肿瘤组织称质量，计算抑瘤率。

抑瘤率＝（模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量）/模型组平均瘤质量×100%

2.5 RT-PCR法检测肺癌组织中VEGF mRNA、HIF-1α、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达取瘤体组织适量，研磨并加入1 mL的Trizol混合均匀，提取上层RNA溶解物后测浓度。取2μg的总RNA进行逆转录，反应条件为37℃反转录15 min，85℃，5 s，合成cDNA。PCR引物序列如表1，PCR扩增反应条件为95℃预变性10 min，95℃，15 s，60℃退火延伸45 s采集信号，重复40个循环。每个组分别做3次定量检测，采用公式Q＝2-ΔΔCt，β-actin为内参，计算mRNA的相对表达量。引物设计，见表1。

2.6 统计学方法采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料以±s的形式表示，运用单因素方差对各组间对比，依照方差齐性进行LSD法及Games-Howell法选择，以P＜0.05具有统计学意义。

3 结果

3.1 对Lewis肺癌小鼠肿瘤抑制率的影响与空白组对比，模型组肿瘤的瘤体质量明显增大（P＜0.05），模型复制成功；与模型组比较，白花蛇舌草多糖各剂量组和顺铂组均可明显降低瘤体质量（P＜0.05）。见表2。

表1 引物序列表

表2 对Lew is肺癌小鼠肿瘤抑制率的影响（±s，n＝10）

表2 对Lew is肺癌小鼠肿瘤抑制率的影响（±s，n＝10）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与空白组比较，#P＜0.05

/%组别剂量/mg·kg-1肿瘤质量（m/g）抑制率空白---模型-2.71±0.32#-顺铂6 0.99±0.16*79.26白花蛇舌草多糖高剂量组200 1.22±0.22*68.66白花蛇舌草多糖中剂量组100 1.47±0.26*57.14白花蛇舌草多糖低剂量组50 1.92±0.34*36.40

3.2 对Lewis肺癌小鼠血清IL-2、IL-10、TNF-α、TFN-γ水平的影响与空白组比较，模型组动物血清中IL-2、TNF-α、TFN-γ水平明显降低，IL-10水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，白花蛇舌草多糖各剂量组和顺铂组均可明显升高模型动物血清中IL-2、TNF-α、TFN-γ水平，降低IL-10水平（P＜0.05）。见表3。

表3 对Lew is肺癌小鼠血清IL-2、IL-10、TNF-α、TFN-γ含量的影响（±s，n＝10）

表3 对Lew is肺癌小鼠血清IL-2、IL-10、TNF-α、TFN-γ含量的影响（±s，n＝10）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与空白组比较，#P＜0.05

组别剂量/mg·kg-1 IL-2（ρ/ng·L-1） IL-10（ρ/ng·L-1） TNF-α（ρ/ng·L-1） TFN-γ（ρ/ng·L-1）空白-3.69±0.31*3.55±0.46*150.27±19.94*19.14±3.05*模型-1.13±0.16#12.13±1.52#62.39±11.28#8.24±1.26#顺铂6 2.62±0.40*5.74±0.91*123.94±13.00*15.71±2.49*白花蛇舌草多糖高剂量组200 2.31±0.34*6.37±1.16*104.49±15.12*17.54±2.80*白花蛇舌草多糖中剂量组100 1.99±0.23*8.18±148*89.85±10.04*11.65±1.46*白花蛇舌草多糖低剂量组50 1.70±0.18*9.22±1.64*83.57±10.69*10.77±1.63*

3.3 对Lew is肺癌小鼠血清VEGF、HIF-1α、MMP-2水平的影响与空白组比较，模型组动物血清中VEGF、HIF-1α、MMP-2水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，白花蛇舌草多糖各剂量组和顺铂组均可明显降低模型动物血清中VEGF、HIF-1α、MMP-2水平（P＜0.05）。见表4。

表4 对Lew is肺癌小鼠血清VEGF、HIF-1α、MMP-2含量的影响（±s，n＝10）

表4 对Lew is肺癌小鼠血清VEGF、HIF-1α、MMP-2含量的影响（±s，n＝10）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与空白组比较，#P＜0.05

组别剂量/mg·kg-1 VEGF（ρ/mg·L-1）HIF-1α（ρ/mg·L-1）MMP-2（ρ/ng·L-1）空白-224.09±36.28*45.29±6.28*144.42±22.36*模型-629.7±91.00#169.53±20.95#345.71±24.58#顺铂6 305.59±59.28*75.55±15.5*196.09±26.05*白花蛇舌草多糖高剂量组200 394.03±51.62*84.62±15.41*217.57±23.31*白花蛇舌草多糖中剂量组100 462.49±72.04*102.05±13.04*244.75±28.53*白花蛇舌草多糖低剂量组50 530.27±46.74*128.34±17.23*262.02±24.20*

3.4 对Lew is肺癌小鼠瘤组织中VEGF m RNA、HIF-1α、Bcl-2 m RNA、Bax m RNA表达影响

模型组动物肿瘤组织中VEGF mRNA、HIF-1α、Bcl-2 mRNA表达明显升高，Bax mRNA及Bcl-2/Bax表达明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，白花蛇舌草多糖各剂量组和顺铂组均可明显降低模型组动物肿瘤组织中VEGF mRNA、HIF-1α、Bcl-2 mRNA表达，升高Bax mRNA及Bcl-2/Bax表达（P＜0.05）。见表5。

表5 对Lew is肺癌小鼠瘤组织中VEGF m RNA、H IF-1α、Bcl-2 m RNA、Bax mRNA表达影响（±s，n＝10）

表5 对Lew is肺癌小鼠瘤组织中VEGF m RNA、H IF-1α、Bcl-2 m RNA、Bax mRNA表达影响（±s，n＝10）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与空白组比较，#P＜0.05

组别剂量/mg·kg-1 VEGF mRNA HIF-1αBcl-2 mRNA Bax mRNA Bcl-2/Bax模型-0.93±0.10 0.96±0.07 1.06±0.17 1.03±0.12 1.03±0.13顺铂6 0.39±0.06#0.67±0.05#0.72±0.12#3.39±0.59#0.21±0.01#白花蛇舌草多糖高剂量组200 0.31±0.04*0.50±0.05*0.76±0.14*3.45±0.37*0.22±0.01*白花蛇舌草多糖中剂量组100 0.63±0.05*0.58±0.05*0.85±0.07*2.37±0.55*0.36±0.03*白花蛇舌草多糖低剂量组50 0.75±0.07*0.71±0.06*0.98±0.05*1.49±0.27*0.65±0.04*

4 讨论

随着工业化和城市化发展，肺癌严重威胁着人类健康和生命［15］。目前已成为当今世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌的发生、发展涉及基因表达的异常、新生血管的形成，信号传导异常等多环节的变化［16-17］。而现今癌症患者的治疗主要以放化疗为主，众多患者难以承受其产生的不良反应，机体免疫功能逐渐降低，身体逐渐垮掉［18-19］。本研究血液指标选取IL-2、IL-10、TNF-α、TFN-γ等免疫指标进行检测。

Bcl-2和Bax作为激活线粒体通路调节细胞凋亡的一对重要信号分子［20］，在外界因素诱导下Bax激活/Bcl-2失活促进线粒体膜电位降低，进而线粒体内外膜交换孔开放，促进细胞色素C等小分子物质释放到细胞浆，通过活化Caspase-3激活核酸内切酶，导致细胞凋亡［21-22］。本次研究发现，白花蛇舌草多糖各剂量组可明显降低模型组瘤组织中Bcl-2含量表达，升高Bax含量表达，升高Bcl-2/Bax的水平，促进癌细胞凋亡。HIF-1α是组织内缺氧的标记物之一［23］，其在多种肿瘤中存在高表达，并可诱导多种与细胞适应缺氧微环境有关的基因表达，是调节肿瘤细胞适应缺氧的核转录因子，在肿瘤细胞的侵袭、转移、永生化、肿瘤血管生成等方面起重要作用。肿瘤血管生成是肿瘤生长及转移最为重要的因素［24］。VEGF是重要的血管生成促进因子，又称血管渗透性因子，可促进血管形成，增加血管通透性，刺激单核细胞及成骨细胞的迁移，诱导蛋白水解酶、组织因子、基质胶原酶等在内皮细胞表达，激活第Ⅷ因子从内皮细胞释放，改变细胞外基质，介导内皮细胞迁移和浸润，利于血管生成［25-26］。研究可知，白花蛇舌草多糖各剂量组可显著降低模型动物瘤组织中VEGF、HIF-α含量表达，从而抑制肿瘤血管生成，抑制肿瘤细胞转移。

本次研究通过建立Lewis肺癌小鼠模型，经药物干预后可知，白花蛇舌草多糖各剂量组均可不同程度升高模型动物血清中IL-2、TNF-α、TFN-γ水平，降低IL-10、VEGF、HIF-1α、MMP-2水平，同时可降低模型动物肿瘤组织中VEGF mRNA、HIF-1αmRNA、Bcl-2 mRNA水平表达，升高Bax mRNA水平表达，抑制肿瘤瘤体的增长。提示白花蛇舌草多糖治疗肺癌模型的主要机制可能与增加模型动物免疫能力及下调瘤体组织中VEGF mRNA、HIF-1α、Bcl-2 mRNA含量表达，升高Bax mRNA表达，从而达到干预肿瘤组织生长转移的作用。