一般对照非抑制蛋白5参与调控牙髓干细胞成牙本质分化

肖静雯，殷巍巍，施素萍*

（1.海门市人民医院口腔科，江苏 海门 226100；2.南通市口腔医院，江苏 南通 226001）

牙髓干细胞（DPSCs）是一种容易获取、来源广泛的间充质干细胞，其拥有独特的生物学特性如具有高度可塑性，能长期自我更新，并且能分泌各种生物活性分子和多向分化成为其他组织的潜能。由于牙髓具有能形成修复性牙本质的独特特性，牙髓中的DPSCs的成牙本质分化潜能在临床中受到越来越多的关注。

GCN5是一种组蛋白乙酰化酶（HAT），也称为赖氨酸乙酰转移酶2A（KAT2A），可作为主要转录激活因子在多种蛋白质的稳定性和细胞增殖的控制中发挥重要作用。相关研究表明，HAT可调节组蛋白乙酰化的染色质程序，并与正常胚胎发生所需的基因转录激活相关联[1]。HAT既可以进行全局和特定位点的组蛋白乙酰化，也可以对非组蛋白进行乙酰化，同时HAT还可以作为转录的共激活子，在基因激活中起重要作用[2]。然而，GCN5对间充质干细胞来源的DPSCs的成牙本质分化的作用原理目前还尚不清楚。

本文主要对GCN5参与调控DPSCs成牙本质分化能力进行研究。这将从基因层面分析出可调控DPSCs的成牙本质分化能力的因素，有利于提高DPSCs在牙本质再生、牙体牙髓疾病及其他疾病等方面的治疗使用，增加其临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集海门市人民医院口腔门诊健康人（18～25岁）的第三磨牙牙髓组织。受试者没有龋病和口腔感染性疾病。研究中的所有方法均按照批准的伦理指南进行。DPSCs的分离与培养见先前研究[3, 4]，使用第三代DPSCs进行后续实验。

1.2 方法

1.2.1 分组

Control组：DPSCs培养基中未加入任何分化诱导物

OD组：DPSCs培养基中加入成牙本质分化诱导物

OD+siGCN5组：siGCN5转染的DPSCs培养基中加入诱导成牙本质分化

1.2.2 DPSCs成牙本质分化诱导

成牙本质诱导培养基的组成成分：每100 mL DMEM培养基中加入10%胎牛血清、100 mg/L链霉素、0.1 U/L青霉素、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、10 nmol/L地塞米松、2 mmol/L谷氨酰胺和50 mg/L抗坏血酸，每隔3天换一次培养液。

1.2.3 siGCN5的构建

s i R N A 转染是利用市场上现有的试剂盒（GENECHEM）实现的。DPSCs生长到培养皿80%时血清饥饿12h。用Lipo2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）以50 nmol/L的最终浓度转染到细胞中。siRNA对人GCN5（siGCN5）靶序列为CCATTCCCTGGCATAA，随后去除转染培养基。

1.2.4 成牙本质分化能力检测

运用Western blot 检测三组中牙本质分化标记物DMP-1和DSPP表达的变化。

1.2.5 牙髓干细胞增殖能力检测

用MTT法评估细胞的增殖。以4×103细胞/孔的浓度将DPSCs接种于24孔板中，用PBS清洗细胞，每孔加入20毫升MTT（5 g/L；Beyotime，中国上海）。在37℃条件下孵育4h后，用二甲基亚砜（DMSO）（Sigma）提取沉淀，在490nm波长处测定光密度（OD）。MTT法分别检测三组中细胞增殖数量，每组取6个平行样本进行统计。

1.3 统计分析

采用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析，两组计量资料采用T检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 siGCN5对DPSCs的增殖没有影响

我们使用MTT法检测来检测siGCN5对DPSCs增殖的影响，结果显示：DPSCs在体外培养24h,48h,72h时，siGCN5对DPSCs的增殖能力的差异无统计学意义（图1）。

图1 MTT法检siGCN5对DPSCs增殖的影响。

2.2 siGCN5抑制DPSCs中成牙本质分化标记基因的表达

我们使用Western blot检测siGCN5对DPSCs中成牙本质分化相关标记基因表达的影响，结果显示：OD组中成牙本质分化标记物DMP-1和DSPP明显高于对照组，而OD+siGCN5组中DMP-1和DSPP水平显著低于成牙本质分化组（P ＜0.05）(图2)，说明了抑制GCN5基因的表达会抑制DPSCs的成牙本质分化。

图2 siGCN5抑制DPSCs中成牙本质分化标记基因的表达

（A）Western blot检测分析转染siGCN5后DMP-1和DSPP的表达情况；（B）定量分析DMP-1和DSPP的蛋白表达水平；所有结果取平均值，n=3（*P ＜0.05）。

3 讨 论

GCN5是一种典型的组蛋白乙酰化酶，已有研究表明HAT的上调可以促进成骨分化，并可调节骨髓间充质干细胞的骨组织形成，同时GCN5有助于Hox基因的调节，通过骨形态发生蛋白(BMP)信号通路促进小鼠骨骼发育[6]。有报道表明HAT抑制剂诱导干细胞迁移，促进牙源性基因表达，增加矿化和牙髓修复能力。但很少有研究GCN5如何影响骨和牙组织的形成，以及这种组蛋白乙酰化是否与最常见的骨纤维皮质缺损有关。

间充质干细胞是一种具有分化为成骨细胞并维持骨稳态平衡的细胞。DPSCs是一组源自牙髓组织的特异性间充质干细胞，可维持牙髓组织的稳态平衡。在龋齿和牙齿损伤的过程中，牙髓中的干细胞具有再生牙本质的能力。现阶段龋病在治疗只能通过去除牙体的腐坏组织，进行树脂等充填治疗，而我们是否能够利用牙齿中牙髓的成牙本质分化的特性来促使其自身修复成为目前研究的新颖点。在我们的既往研究中已经表明DPSCs是一组来源于牙髓的间充质干细胞，并且其具有多向分化潜能，其中包括成骨分化、脂肪生成和软骨生成等等，并且和骨髓间充质干细胞相比，DPSCs具有更高克隆能力、增殖能力和多向分化能力[4]。DPSCs的这些独特的生物学特性为我们在治疗和修复牙本质缺损时提供了一种新的思路，也成为了诱导牙本质分化中的重要细胞。

而GCN5和DPSCs之间的关系还没有被完全了解。为了研究GCN5的潜在功能，我们建立了GCN5稳定敲除的牙髓干细胞，并检测了siGCN5对牙髓干细胞成牙分化能力的影响。GCN5作为一种转录激活因子，在细胞分化过程中具有重要作用。我们的结果首次证明了GCN5基因的敲除可抑制了DPSCs的成牙本质分化标记物DMP-1和DSPP的表达，初步证明了GCN5与牙髓干细胞分化相关。GCN5对 DPSCs的分化具有重要的调控作用，这将有望成为促进 DPSCs在牙组织分化工程中应用的治疗基因靶点，但其具体分子机制还需要进一步的研究来阐明。基于目前的发现，我们提出了GCN5在牙体缺损或者龋病发展中的新作用。GCN5的这一新功能可能为调控DPSCs成牙本质分化提供有价值的知识。